帕金森病是一种神经退行性疾病,其发病率仅次于阿尔茨海默病。该病的主要的病理特征是中脑黑质致密区多巴胺能神经元特异性死亡。该区的多巴胺能神经元的死亡伴随投射到纹状体的多巴胺神经递质水平减少,破坏了黑质-纹状体系统从而妨碍了它执行平衡运动的功能。因而该病主要的临床表现包括静止振颤、运动缓慢、肌肉僵直、姿势不稳等。据流行病学调查现阶段该病影响着1%-2%50岁以上的人群,并且在85岁以上的老年人群中该病的发病率达到5%。当帕金森病病人出现上述临床表现时,脑内的多巴胺能神经元已经死亡50%-70%,现阶段临床上还没有治愈该病的方法。自1817年帕金森医生介绍帕金森病的病况开始,左旋多巴就一直作为最有效的药物使用到现在,但是该药只是补充脑内的多巴胺,对症治疗只能减缓病程的发展而不能挽救多巴胺能神经元的死亡。此外,更为重要的是服用该药一段时间后药效会逐渐降低,运动能力会发生障碍而且出现“开-关”(on-and-off)现象。临床研究显示服用该药5年,50%的病人会出现上述的并发症,服用该药10年,80%的病人会出现上述的并发症,几乎所有的年轻病患服用后都会出现上述的并发症。由于帕金森病影响着全球的老年人,因此全球都关注并致力研究该病,但是目前为止此病病因尚不明确。现在普遍认为与遗传因素和环境因素有关。遗传是导致家族性帕金森病发病的主要原因,迄今为止已经发现十六个与帕金森病相关的基因,目前研究比较多的是α-Synuclein、Parkin、LRRK2、DJ-1、Pink-1、UCHL-1等。其实家族性帕金森病只占帕金森病总发病率的5%-10%,更多的帕金森病是由于后天环境因素引起的。环境因素在帕金森病发病中的重要作用最初是从人们发现MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)这一神经毒性物质开始。早在上世纪八十年代已有科学家发现一群吸食海洛因的青年出现与帕金森病相似的病征,后来研究发现MPTP能够通过人的血脑屏障被单胺氧化酶代谢为离子形式(MPP+),然后被多巴胺转运体选择性吸收进入线粒体,破坏线粒体复合物Ⅰ,诱导多巴胺能神经元产生过多的氧化应激产物,从而导致多巴胺能神经元的死亡。由于MPTP的发现人们越发重视环境中一些化学物质,后来研究发现长期暴露在农药、杀虫剂等化学物质中会比较大机会罹患帕金森病。随着后来研究的深入,人们发现了帕金森病患者脑内出现名为路易斯体的蛋白聚集体,到了 1997年人们发现路易斯体的主要成份是α-Synuclein的突变体。近年来人们除了发现线粒体功能受损、蛋白异常堆积、氧化应激是引起多巴胺能神经元死亡机制之外,炎性因子的作用也备受关注。尽管对于帕金森病的研究一直没有停歇,但是目前对于帕金森病病因尚不完全清楚,更不能给临床治疗起到很好的指导作用。本课题针对散发性的帕金森病,研究是否存在一种机制能够降低多巴胺能神经元对环境中刺激因素的反应性,从而保护多巴胺能神经元。环氧化物水解酶(epoxide hydrolase)是广泛存在于体内各组织的一种酶。它能催化水解体内具有毒性的亲电子物质,从而减少它们的活性,因而它们被称为经典的解毒酶。体内环氧化物水解酶分为两种,一种主要存在于微粒体,名为微粒体环氧化物酶(microsomal epoxide hydrolase,mEH),另外一种主要存在于胞质内,称为可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)。花生四烯酸(Arachidonic Acid,AA)是人体广泛存在而且是必需的一种不饱和脂肪酸,它在生物体内主要以磷脂的形式存在于细胞膜上,在磷脂酶A2和磷脂酶C的作用下分解成游离的AA。游离的AA在体内主要通过三条途径代谢成为类花生烯酸。环氧二十碳烯酸(epoxyeicosatrienoicacids,EETs)主要来源于花生四烯酸-细胞色素P450(CYP450)代谢途径。可溶性环氧化物水解酶(sEH)在体内主要参与环氧二十碳烯酸(EETs)的代谢和失活作用。在人体外周系统EETs能够舒张血管对抗高血压,同时还有抗炎作用,在中枢神经系统EETs被认为在调节局部血流、保护缺血性损伤、抗炎、调节色素释放和发热方面有重要作用,但是其在帕金森病中的作用目前还不清楚。由于环氧化物水解酶水解EETs后能够减弱或者灭活它的活性,因此抑制环氧化物水解酶能够提高体内EETs水平,提高体内EETs水平所引起的一些生物效应可以作为临床应用的一种策略。本课题采用可溶性环氧化物水解酶(sEH)基因敲除小鼠和野生型C57BL/6小鼠杂交得出的sEH(+/-)小鼠交配所生的sEH(-/-)小鼠作为实验组,同代的sEH(+/+)小鼠作为对照组建立MPTP-帕金森病小鼠模型。检测sEH(-/-)小鼠与sEH(+/+)小鼠对MPTP引起的神经毒性反应是否存在差异,并探讨其发生的机制。我们首先建立C57BL/6小鼠帕金森病动物模型。根据文献报道我们使用周龄为8-10周的雄性小鼠建立急性帕金森病动物模型。急性动物模型是连续2天腹腔注射40mg/kg的MPTP,对照组腹腔注射相同体积的生理盐水。从最后一次注射算起的第14天进行脑组织灌注回收,冰冻切片,免疫组化染色,细胞计数。结果显示:对照组的细胞个数是137±3,MPTP处理组的细胞个数是73±6,两组比较P<0.001,有统计学差异。这提示帕金森病小鼠模型建立成功。下一步我们对sEH(+/-)交配小鼠所生下来的sEH(+/+)和sEH(-/-)小鼠进行基因型鉴定。我们采用了 PCR(Polymerase Chain Reaction)方法进行基因型鉴定,western blotting和免疫荧光化学的方法进行蛋白表达缺失鉴定。PCR结果显示sEH(+/+)小鼠只扩增出338bp条带,sEH(-/-)小鼠只扩增出295bp条带,sEH(+/-)小鼠则能扩增出两条条带。Western blotting显示sEH(-/-)小鼠的脑组织并不表达sEH蛋白,免疫荧光化学实验也证明sEH蛋白并不表达在基因敲除老鼠新生鼠原代培养的皮层神经元里。基因型确定后,我们把sEH(-/-)小鼠和sEH(+/+)小鼠分别建立急性的帕金森模型,对照两组实验结果。有研究表明敲除sEH的同功酶mEH的基因能够降低其黑质致密区多巴胺能神经元对MPTP的敏感性。为了检测敲除sEH基因(sEH(-/-))是否同样能够降低黑质致密区多巴胺能神经元对MPTP的敏感性,我们把12只sEH(-/-)小鼠分两组,每组6只,一组连续两天接受40mg/kgMPTP注射,另外一组接受同样体积的生理盐水注射。另外12只sEH(+/+)小鼠也接受同样的分组和处理。从最后一次注射算起的第14天进行脑组织灌注回收,冰冻切片,免疫组化染色,细胞计数。结果显示:sEH(+/+)对照组小鼠黑质多巴胺能神经元个数是140±5,sEH(+/+)/MPTP处理组小鼠细胞个数是65±9;sEH(-/-)对照组小鼠黑质多巴胺能神经元个数是139±8,sEH(-/-)/MPTP处理组小鼠细胞个数是98±4。sEH(+/+)对照组和sEH(-/-)对照组比较没有统计学差异。sEH(+/+)/MPTP处理组和sEH(-/-)/MPTP处理组比较P<0.01,有统计学意义。这提示了,敲除sEH基因能够减低黑质致密区多巴胺能神经元对神经毒性物质MPTP的敏感性。为了进一步证明sEH(-/-)小鼠能够对抗MPTP对多巴胺能的神经毒性作用,确实由于sEH特异性作用引起的,我们应用环氧化物水解酶抑制剂AUDA(12-(3-adamantan-1-yl-ureido)dodecanoic acid)。sEH(+/+)小鼠连续灌胃 4 天,在第三天开始连续2天腹腔注射40mg/kg MPTP。结果显示:对照组小鼠黑质多巴胺能神经元个数是133±4,MPTP处理组小鼠细胞个数是81±7;AUDA组小鼠黑质多巴胺能神经元个数是135±4,MPTP+AUDA处理组小鼠细胞个数是120±5。sEH(+/+)对照组和AUDA对照组比较没有统计学差异。MPTP处理组和MPTP+AUDA处理组比较P<0.001,有统计学意义。提示抑制sEH的活性确实能够降低多巴胺能神经元对MPTP的敏感性。研究表明抑制可溶性环氧化物水解酶,能直接地提高体内的EETs水平,其中11,12-EET和14,15-EET生物活性最高。为了探讨sEH(-/-)相比sEH(+/+)小鼠能够更好的对抗MPTP的神经毒性是由于体内EETs水平升高所致,我们应用 14,15-EET 抑制剂 EEZE(14,15-epoxyeicosa-5(Z)-enoicacid),观察抑制小鼠体内的EETs作用后能否降低sEH(-/-)小鼠多巴胺能神经元对抗MPTP引起的毒性作用的能力?我们在8-10周sEH(-/-)小鼠在接受MPTP注射前30min侧脑室里微量注入1.5μ吨/只EEZE。结果显示:生理盐水组小鼠黑质多巴胺能神经元个数是144±12,MPTP处理组小鼠细胞个数是100±6,MPTP +EEZE组小鼠黑质多巴胺能神经元数目为63±9。MPTP处理组小鼠黑质多巴胺能神经元个数与MPTP+EEZE组比较P<0.05,差异有统计学意义。这提示了,sEH(-/-)相比sEH(+/+)小鼠能更好对抗MPTP的神经毒性作用是由于体内EETs水平升高所致,抑制14,15-EETs能够阻断其对多巴胺能神经元的保护作用。为了进一步证明EETs的保护作用,我们在8-10周sEH(+/+)雄性小鼠接受MPTP注射前30min侧脑室微量分别注射2μg11,12-EET或14,15-EET。结果显示:对照组多巴胺能神经元个数是140±5,MPTP处理组多巴胺能神经元个数65±9,11,12-EET+MPTP多巴胺能神经元的细胞个数是70±8,14,15-EET+MPTP黑质多巴胺能神经元的细胞个数是93±3,MPTP处理组多巴胺能神经元个数与14,15-EET+MPTP组神经元的细胞个数比较,P<0.001,两组比较有统计学意义。这提示了 14,15-EET能够保护多巴胺能神经元受到MPTP的毒性作用。上述实验证明提高体内EETs水平能够对抗MPTP诱导的神经毒性,然而sEH(-/-)小鼠的侧脑室注入2μg EETs对多巴胺能神经元没有进一步的保护作用。结果显示:sEH(-/-)小鼠的多巴胺能神经元在MPTP处理组、MPTP+11,12-EET处理组和MPTP+14,15-EET处理组各组间都没有统计学意义,P>0.05。这进一步提示了sEH(-/-)小鼠脑内的EETs水平对多巴胺能神经元的保护作用确实由其体内升高的EETs所致。为了进一步证明sEH(-/-)能够降低神经元对MPTP的敏感性,我们采取体外培养sEH(-/-)和sEH(+/+)的皮层神经元,建立帕金森病的细胞模型。对两种基因型的原代培养皮层神经元进行20μM和40μM两种浓度的MPP+处理,分别处理24小时、48小时和72小时。结果显示:在20μM MPP+处埋24小时后的皮层神经元里,野生型与基因敲除型的皮层神经元的细胞存活率分别是73%±7.46%和86%±7.54%,没有统计学意义。在处理48小时后野生型与基因敲除型的皮层神经元的细胞存活率分别是48%±4.88%和65%±8.93%,P<0.05具有统计学意义。处理72小时后,野生型与基因敲除型的皮层神经元的细胞存活率分别是39%±4.12%和55%±11.06%,P<0.05具有统计学意义。在40μM MPP+处埋24小时后的皮层神经元里,野生型与基因敲除型的皮层神经元的细胞存活率分别是68%±15.7%和76%±13.1%,没有统计学意义。在处理48小时后野生型与基因敲除型的皮层神经元的细胞存活率分别是47%±6.5%和63%±10.2%,P<0.05具有统计学意义。处理72小时后,野生型与基因敲除型的皮层神经元的细胞存活率分别是35%±6.2%和50%±9%,P<0.05具有统计学意义。以上提示了帕金森病细胞模型建立成功,而且sEH(-/-)小鼠原代培养的皮层神经元相比sEH(+/+)原代培养的皮层神经元更能抵抗MPP+引起的神经毒性作用。为了证明EETs是通过参与PI3K/AKT信号传导通路促进细胞存活,培养七天的皮层神经元用20μM MPP+处理Oh、1h、4h、8h、12h后进行western blotting。结果显示AKT活性有上升趋势。这提示了 EETs可能激活PI3K/AKT信号通路。综上所述,环氧化物水解酶基因敲除小鼠相比野生型的小鼠更能抵抗MPTP引起的多巴胺能神经元的死亡。体外给予野生型小鼠环氧化物水解酶抑制剂能够模拟其基因敲除后对抗MPTP毒性的作用。在环氧化物水解酶基因敲除小鼠身上给予外源性EETs抑制剂能够逆转敲除sEH所引起的保护作用。给予外源性的EETs能够保护野生型小鼠多巴胺能神经元受MPTP的损伤,但不能更进一步保护基因敲除小鼠的多巴胺能神经元。环氧化物水解酶基因敲除小鼠原代培养的皮层神经元比野生型小鼠原代培养的皮层神经元更能抵抗MPP+引起的毒性作用,EETs可能通过激活PI3K/AKT信号通路促进神经元的存活。