构建钛表面淫羊藿苷/阿司匹林复合涂层调控巨噬细胞行为促进成骨细胞活性的研究

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目的:钛及钛合金因其优异的特性而成为应用最广泛的种植体材料,然而未经处理的纯钛种植体其生物惰性不利于细胞早期粘附和快速骨结合。同时随着“骨免疫”概念的提出,越来越多的学者将目光投向种植体周围骨免疫微环境的建立和维持对种植体骨结合的影响。因此对种植体表面改性来调节种植体周围免疫微环境,促进细胞活性,进而促进骨结合,提高种植义齿成功率具有重要的理论和实际意义。本研究通过阳极氧化,在种植体表面形成纳米形貌,在其表面依次负载淫羊藿苷和阿司匹林,构建淫羊藿苷/阿司匹林复合涂层,从而实现调节种植体周围免疫微环境,促进种植体周围成骨的目的。方法:1.通过阳极氧化在纯钛表面制备二氧化钛纳米管,浸泡加载淫羊藿苷,随后涂覆阿司匹林与聚乳酸羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)混合后的溶液,制备钛表面淫羊藿苷/阿司匹林复合涂层,扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察表面形貌,X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)检测表面元素含量,接触角测量仪检测其表面亲水性,高效液相色谱分别评价涂层中淫羊藿苷与阿司匹林的药物释放情况。2.在不同样本表面接种RAW 264.7巨噬细胞,利用CCK-8检测不同样本的细胞增殖情况;SEM观察细胞早期粘附形态;实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction)检测不同材料表面RAW 264.7巨噬细胞经LPS诱导后,M1炎性基因TNF-α(tumor necrosis factor-α)、IL-1β(interleukin-1β)和M2修复基因TGF-β(transforming growth factor-β)、HO-1(heme oxygenase-1)的表达情况;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测RAW 264.7巨噬细胞TNF-α、IL-1β、TGF-β、HO-1等蛋白分泌情况。3.在不同样本表面接种MC3T3-E1成骨细胞,利用CCK-8检测不同样本上细胞的增殖情况;SEM观察细胞早期粘附形态;Real-time PCR检测MC3T3-E1成骨细胞的成骨相关基因OCN(osteocalcin)的表达水平。4.通过采集巨噬细胞上清液,添加到MC3T3-E1成骨细胞的培养液中制备条件培养基,构建成骨细胞与RAW 264.7巨噬细胞的共培养模型。利用CCK-8检测成骨细胞与巨噬细胞共培养条件下不同样本上成骨细胞的增殖情况;SEM观察成骨细胞早期粘附形态;Real-time PCR检测成骨细胞的成骨相关基因OCN(osteocalcin)、OPN(osteopontin)、COL1A1(collagen-1A1)、ALP(alkaline phosphatase)的表达水平;Western blot实验检测OCN、OPN、COL1A1、ALP蛋白的表达水平。结果:1.SEM观察和XPS检测证实淫羊藿苷/阿司匹林复合涂层成功制备,复合涂层的亲水性强于纯钛。淫羊藿苷的释放周期达到30天,并且释放浓度维持在0.1-1×10-5mol/L;阿司匹林的释放周期达7天,前5天的释放浓度维持在0.2 m M至4 m M之间。2.加载淫羊藿苷与阿司匹林复合涂层的钛片对于巨噬细胞无细胞毒性。通过Real-time PCR与酶联免疫吸附测定(ELISA)实验得出复合涂层对于LPS刺激的巨噬细胞具有一定抑制炎症因子TNF-α、IL-1β基因与蛋白表达、促进修复性细胞因子TGF-β、HO-1基因与蛋白表达的作用。3.加载淫羊藿苷与阿司匹林复合涂层的钛片具有明显的促进成骨细胞增殖作用。Real-time PCR证明复合涂层上的成骨相关基因OCN有明显上调。4.在成骨细胞与巨噬细胞共培养条件下,在巨噬细胞条件培养液存在的情况下,加载有淫羊藿苷与阿司匹林的复合涂层钛片显著促进成骨细胞增殖。SEM观察发现,复合涂层钛片表面的成骨细胞向四周伸展,表现出良好的粘附能力。Real-time PCR与Western blot实验证明复合涂层与纯钛相比,可上调成骨相关基因(OCN、OPN、COL1A1、ALP)与成骨相关蛋白(OCN、OPN、COL1A1、ALP)表达。结论:本实验为钛种植体表面改性方式提供了一种新思路,利用淫羊藿苷与阿司匹林,通过利用这两种药物的抗炎及免疫调节效果和促成骨作用,调控药物释放行为,使得阿司匹林在早期发挥抗炎作用,而淫羊藿苷持续发挥促成骨效应,二者协同营造促进成骨的免疫微环境,促进种植体骨结合。
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