研究目的和内容:1.为了解不同宿主香港海鸥菌(Laribacter hongkongensis,LH)的检出情况,收集广州市某医院门诊腹泻患者、肝病住院患者、健康人群、野生型褐家鼠粪便标本及淡水产品肠标本进行检测。2.为进一步研究香港海鸥菌的致病机制,以裸鼠为动物模型,探讨不同宿主来源菌株的致病性。3.为了解不同宿主来源的LH的基因组相似性和差异性,通过全基因组测序,对基因组的特点、多态性等进行分析。研究方法1.标本收集:收集门诊腹泻患者、肝病病人及健康人群粪便标本;采集褐家鼠粪便标本及淡水产品(草鱼、虎纹蛙)肠拭子。2.LH菌株的分离鉴定:生化初筛及PCR扩增特异性片段确认。3.LH菌株的耐药性表型测定:纸片扩散法。4.MLST分型:采用港大的MLST方案,确定LH菌株的等位基因谱及ST号。5.LH感染裸鼠:采用经口灌胃方式,共6个实验组和1个对照组。实验组有腹泻病人来源株HLHK9和LH679、肝病病人分离株LHNF250、褐家鼠分离株LHR251、草鱼分离株LHY19、虎纹蛙分离株LHW73。6.基因组测序:采用第二代测序技术IlluminaHiSeq2000,测序的菌株包括LHNF250、LHR251、LHY19、LHW73。研究结果:1.LH检出情况:从600份肝病病人粪便标本中分离到1株LH,腹泻病人(168份)和健康人群粪便标本(500份)未检出;野生型褐家鼠粪便标本191份,检出率为1.05%(2/191);草鱼肠内容物拭子37份,阳性率为32.4%(12/37);虎纹蛙肠内容物拭子21份,阳性率为71.4%(15/21)。2.药敏结果:30株LH对19种抗生素中的14种均存在一定程度的耐药。总耐药率最高的为头孢噻吩(100%),其次为头孢唑啉(96.7%)、利福平(93.3%)、头孢哌酮(93.3%);对头孢吡肟、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素和阿米卡星5种抗生素均表现为敏感。4.MLST分型:肝病病人分离株LHNF250和褐家鼠分离株LHR251、LHR398的分型分别为ST-162、ST-163、ST-164。谱系及聚类分析显示ST-162、ST-163和ST-164分散存在,鼠源分离株R398与人源分离株的亲缘关系较近。5.LH感染裸鼠:6个实验组的所有裸鼠均未发生腹泻,病理切片显示结肠组织的病变程度(退变、炎性细胞浸润和肠粘膜萎缩)从高到低分别为:LH679、HLHK9、LHW73>LHR251>LHY19、LHNF250,肝脏组织的病变程度(肝血窦扩张、干细胞水肿和淋巴细胞浸润)从高到低为:LH679>HLHK9、LHW73>LHR251>LHY19、LHNF250。6.基因组序列分析:LHNF250、LHR251、LHY19、LHW73的基因组大小分别为 3,072,799bp、3,063,288bp、3,265,250bp、3,205,168bp;预测编码基因分别有2,880个、2,879个、3,113个、3,031个;基因组平均GC含量分别为62.35%、62.40%、62.53%、62.48%;分别有 65 个、63 个、62 个、64 个 tRNA。研究结论1.从一名肝硬化病人的粪便中分离到LH,提示肝硬化可能为LH感染的潜在危险因素;从褐家鼠粪便中检出LH,提示褐家鼠可能是除人和淡水生物以外的另一个LH的潜在宿主;LH在淡水鱼和虎纹蛙的阳性率与之前文献报道的一致。上述发现有助于我们更加全面了解LH在自然界中的分布情况。2.所有LH分离株至少对1个种类的抗生素表现耐药。大部分菌株对利福平及第一、三代头孢菌素类抗生素表现为耐药,而对第二、四代头孢菌素类表现为较低的耐药性。3.肝病病人和褐家鼠分离株为新的ST型,聚类分析提示鼠来源株与腹泻病人来源株有更近的亲缘关系,但两者之间的联系有待进一步研究。4.根据结肠组织及肝脏组织的病理切片显示的不同程度病变提示提示菌株间的毒力可能存在差异性;初步探讨了不同宿主来源的LH的致病性,完善了LH的基础实验数据。5.不同宿主来源的4株LH测序菌株的基因组大小、GC含量和基因组组分基本一致,多重耐药菌株基因组携带编码其耐药的相关基因。