疫苗是畜牧生产中控制动物传染病的重要工具,但在临床实际中存在疫苗免疫失败和油佐剂疫苗注射困难等现象。我们前期的研究表明,GSLS和油佐剂有协同作用,能提高疫苗的免疫效果。本论文在此基础上,进一步研究GSLS和油佐剂协同作用增强疫苗免疫效果的合适比例,观察GSLS与油佐剂组合增强猪FMD疫苗和鸡ND疫苗的免疫效果,并对油佐剂疫苗添加GSLS后的黏滞度进行了观察。研究结果可为应用GSLS改进动物疫苗提供参考。1.FMD疫苗中添加不同剂量GSLS对小鼠免疫反应的影响目的：观察GSLS对小鼠注射FMD油佐剂疫苗免疫佐剂作用,筛选GSLS对FMD由乳剂疫苗免疫佐剂作用的合适浓度。方法：将56只雌性ICR小鼠随机分为7组,组1小鼠皮下注射0.1ml的FMDV抗原+0.1ml生理盐水,组2-7每组小鼠腹部皮下分别注射含不同浓度GSLS(0、2、4、6、8和10μg/0.2ml)的FMD由乳剂疫苗,小鼠免疫2次,间隔3周。二免后2周采血,用双抗夹心ELISA方法检测血清中FMDV特异性IgG水平。结果：疫苗中添加4、6、8和10μg的GSLS能显著提高小鼠血清中FMDV特异性IgG水平(P<0.05),其中以4μg组的FMDV特异性IgG水平最高。结论：FMD油乳剂疫苗中添加GSLS可显著提高小鼠的FMDV特异性IgG水平,提高的幅度呈剂量依赖关系,以4μg组的幅度最高。2. GSLS对低剂量抗原FMD油乳剂疫苗免疫效果的影响目的：比较FMD全抗原剂量油乳剂疫苗和含GSLS的低剂量抗原油乳剂疫苗对小鼠的免疫效果。方法：将72只ICR小鼠随机分成9组,每组8只小鼠。各组动物皮下注射的实验疫苗组成如下：(1)100μl的FMDV抗原+100μl生理盐水；(2)100μl抗原+100μl油佐剂Oil#10；(3)100μl抗原+100μl油佐剂MC52；(4)～(6)100μl,50μl或25μl抗原+100μl油佐剂Oil#10+GSLS(4μg);(7)～(9)100μl,50μl或25μl抗原+100μl油佐剂MC52+GSLS(4μg)。免疫2次,间隔3周,每次注射的体积为200μl。二免后2周采血,并取脾脏制备脾脏淋巴细胞悬液。用双抗夹心ELISA检测血清中FMDV特异性IgG水平,用MTT法检测经ConA、LPS和FMDV刺激后的淋巴细胞增殖指数,并用RT-PCR方法检测脾脏淋巴细胞经FMDV刺激后的IFN-y和IL-4以及转录因子T-bet和GATA-3中mRNA表达水平。结果：含GSLS的油佐剂疫苗诱导的特异性IgG效价显著高于不含GSLS的油佐剂疫苗(P<0.05)；含GSLS的半剂量抗原的油乳剂疫苗诱导的血清特异性IgG效价高于不含GSLS的全剂量抗原油乳剂疫苗,但无统计学差异显著(P>0.05)；含GSLS的四分之一剂量抗原的油乳剂疫苗诱导的血清特异性IgG效价低于不含GSLS的全剂量抗原油乳剂疫苗,但无统计学差异(P>0.05)。此外,油乳剂疫苗中添加GSLS后,增强了小鼠脾脏淋巴细胞受Con A、 LPS和FMDV刺激产生增殖能力(P<0.05),提高脾脏淋巴细胞受FMDV刺激后IFN-γ、IL-4、T-bet和GATA-3的(?)nRNA表达水平(P<0.05)。结论：油佐剂疫苗中添加GSLS能显著增强小鼠的体液和细胞免疫应答,使仅含一半抗原剂量疫苗诱导的IgG水平到含全剂量抗原诱导的IgG水平。3.FMD油佐剂疫苗中添加不同剂量GSLS对猪的免疫效果目的：观察FMD油佐剂疫苗添加GSLS寸猪的免疫效果。方法：试验一：将48只猪随机分成6组,每头猪颈部分别皮下注射含GSLS为0μg、10μg、20μg、40μg、80μg和160μg的FMD疫苗,免疫2次,间隔3周,每次注射疫苗剂量2ml。在免疫前,免疫后第3、6周前腔静脉采血,用正向间接血凝法检测血清中IHA水平,并分离淋巴细胞,用MTT法检测淋巴细胞增殖。试验二：将24头猪随机分成4组,每头猪颈部皮下分别注射含不同佐剂FMD疫苗(Oil#10,MC52, Oil#10+40μg GSLS, MC52+40μg GSLS),免疫1次,注射体积为2ml。于免疫前,免疫后第3、6周前腔静脉采血,检测血清中IHA效价,IgG和IgG亚类水平。结果：试验一：免疫后3、6周,每个剂量的FMD疫苗中添加40μg GSLS能显著提高猪特异性IHA效价(P<0.05),外周血淋巴细胞受FMDV刺激后产生的增殖能力显著升高(P<0.05),而受Con A刺激后产生的淋巴细胞增殖能力高于对照组,但无统计学差异(P>0.05)。试验二：与不添加GSLS的对照组相比,添加GSLS的油佐剂疫苗组在免疫后3周,IHA效价升高不显著(P>0.05),IgG、IgG1和IgG2水平显著升高(P<0.05)；免疫后6周,血清中IHA效价显著升高(P<0.05),IgG、IgG1和IgG2水平均显著上升(P<0.05)。结论：每个剂量FMD油佐剂疫苗中添加40μg GSLS能显著增强猪的体液免疫和细胞免疫。4.不同剂量GSLS对鸡新城疫油佐剂疫苗免疫的影响目的：观察鸡ND疫苗中添加GSLS对鸡免疫反应的影响。方法：将60只1日龄梅岭土鸡分成5组,每组12只,12日龄时,在每只鸡的胸大肌内分别注射含不同剂量的GSLS (0、2、4、6和8μg)鸡ND油佐剂疫苗,免疫为0.2ml。于免疫前,免疫后1、2和3周经心脏采血收集血样,用血凝抑制试验测定血清HI效价,3周后摘取鸡脾脏,制备脾脏淋巴细胞悬液,采用MTT法检测脾脏淋巴细胞增殖。结果：每剂量疫苗中添加6μg的GSLS,血清HI效价在免疫后1周升高不显著,在免疫后第2周和第3周,显著升高(P<0.05)；免疫后3周,脾脏淋巴细胞对LPS和NDV刺激的增殖反应显著高于对照组(P<0.05),各组脾脏淋巴细胞对ConA刺激的增殖反应之间没有明显差异(P>0.05)；ND疫苗中添加GSLS对鸡的体重不产生显著差异(P>0.05)；各组鸡的疫苗注射部位没有发现明显的局部副作用。结论：ND疫苗中添加GSLS能显著增强鸡的体液免疫和细胞免疫应答水平,并对免疫鸡不产生可见的副作用。5.油佐剂疫苗中添加GSLS对疫苗黏滞性的影响目的：观察油佐剂疫苗中添加GSLS对疫苗黏滞性的影响。方法：将GSLS(30g)溶解在60ml二甲基亚砜中,制备361mg/ml的GSLS储存液(83m1),根据用量将GSLS储存液添加在MC52白油中并搅拌均匀,然后与FMDV抗原混合,采用均质乳化机制备分别制备油相/水相比为1比1(或2比1),吐温浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的油包水型FMD油乳剂疫苗,采用玻璃粘度计测定各组疫苗的黏滞性。结果：当吐温浓度为1.0%和1.5%时,添加4μg/剂量GSLS油佐剂疫苗(1比1)流动时间显著短于对照组(P<0.05)；当吐温浓度为为1.5%和2.0%时,添加4μg/剂量GSLS能显著降低油佐剂疫苗(2比1)流动时间(P<0.05)。结论：油乳剂疫苗中添加GSLS能降低疫苗的黏滞性。综上所述,FMD油乳剂疫苗中添加GSLS可显著提高小鼠血清特异性IgG水平,提高的幅度呈剂量依赖关系,以4μg组的幅度最高；FMD油佐剂疫苗中添加GSLS(?)显著增强小鼠血清FMDV特异性IgG水平和淋巴细胞增殖转化指数,增强使仅含一半抗原剂量疫苗诱导的IgG水平到含全剂量抗原诱导的IgG水平,说明GSLS增强小鼠对低剂量抗原疫苗的免疫应答；FMD疫苗中添加40μg的GSLS能显著增强猪血清IHA,IgG和IgG亚类水平,增强淋巴细胞增殖指数,表明GSLS对猪FMD疫苗具有较好的免疫佐剂作用；ND疫苗中添加6μgGSLS能显著增强鸡血清HI效价和淋巴细胞增殖转化指数,并且没有对免疫鸡产生明显可见的副作用,说明GSLS能通过增强鸡的体液免疫应答和细胞免疫应答来发挥免疫佐剂作用；当吐温浓度为1.0%和1.5%时,添加4gg/剂量GSLS由佐剂疫苗(油/水=1：1)流动时间显著短于对照组(P<0.05)；当吐温浓度为为1.5%和2.0%时,添加4Pg/剂量GSLS能显著降低油佐剂疫苗(油/水=2：1)流动时间(P<0.05),说明油乳剂疫苗中添加GSLS能降低疫苗的黏滞性。