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第一部分T-ALL细胞株RAS基因编码区突变状况目的:检测在T细胞急性淋巴细胞白血病(acute T-lymphocytic leukemia,T-ALL)细胞株中,RAS基因编码区序列是否发生点突变及突变类型的分布信息。方法:利用血液/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒纯化8个人T-ALL细胞株Loucy、MOLT-4、CCRF-CEM、CUTLL1、HPB-ALL、Jurkat、PEER、P12-ICH的DNA,利用PCR法分别扩增各个细胞的RAS基因编码区序列,送至擎科公司进行测序。经T-A克隆后,利用Sanger法分别对KRAS、NRAS、HRAS基因的编码区测序;利用DNAMAN软件和Chromas软件进行序列与峰图比对,检验8个T-ALL细胞株中RAS基因的点突变情况。结果:在所纳入的8个T-ALL细胞株(Loucy、MOLT-4、CCRF-CEM、CUTLL1、HPB-ALL、Jurkat、PEER、P12-ICH)中,对于KRAS基因,发生错义突变的细胞株共有两种,分别为Loucy和P12-ICH细胞,均为p.KRASG12D突变,蛋白翻译由甘氨酸转变为天冬氨酸,其余6种T-ALL细胞株经过序列和峰图比对均未发现任何类型的突变。对于HRAS基因,T-ALL细胞株发生了同义突变,其中,在Loucy细胞发现c.177C>T,导致HRAS第7号外显子的22位密码子同义突变,蛋白翻译为丙氨酸;在其余6株T-ALL细胞株中发现c.81T>C,导致HRAS第6号外显子的27位密码子同义突变,蛋白翻译为组氨酸。对于NRAS基因,8种T-ALL细胞株均未发现任何类型的突变。结论:RAS基因作为最常见的癌基因,在本实验中,T-ALL细胞株中的Loucy细胞与P12-ICH细胞发现p.KRASG12D突变,突变发生在第12位常见激活性突变位点,提示KRAS在T-ALL中可发挥促癌作用,须进一步阐释KRAS对T-ALL细胞株的具体作用机制。第二部分抑制RAS活性对T-ALL细胞株体外生存的影响目的:通过使用不同RAS抑制剂分别处理8种T-ALL细胞株,并计算其IC50值,检测对T-ALL细胞株有效的RAS抑制剂,及处理后T-ALL细胞株的体外生存变化,为探索RAS对T-ALL细胞株体外生存的具体机制奠定基础。方法:使用四种RAS抑制剂pan-RAS inhibitor Compound 3144(KRAS、NRAS及HRAS抑制剂)、Tipifarnib(KRAS及NRAS抑制剂)、BI-3406及BAY-293(SOS1抑制剂,阻止SOS-RAS相互作用),以不同浓度梯度分别作用于8种T-ALL细胞株(Loucy、MOLT-4、CCRF-CEM、CUTLL1、HPB-ALL、Jurkat、PEER、P12-ICH),观察处理后细胞的生长情况;利用Annexin V-PE/7-AAD双染色法和流式细胞术检测不同RAS抑制剂处理后8种T-ALL细胞株的凋亡情况。结果:除了ETP-ALL细胞系PEER细胞(IC50=47.916μmol/L)外,Compound 3144对其它7种T-ALL细胞株均有一定的杀伤作用,IC50分别是CCRF-CEM IC50=2.085μmol/L,HPB-ALL IC50=5.469μmol/L,CUTLL1 IC50=3.275μmol/L,Jurkat IC50=4.738μmol/L,Loucy IC50=4.344μmol/L,MOLT-4 IC50=3.017μmol/L,P12-ICH IC50=7.208μmol/L;同样,Tipifarnib对除ETP-ALL细胞系PEER(IC50=94.2265μmol/L)外的其他7种T-ALL细胞株均有一定的杀伤作用,IC50分别为CCRF-CEMIC50=13.62μmol/L,HPB-ALL IC50=7.1μmol/L,CUTLL1 IC50=10.64μmol/L,Jurkat IC50=12.28μmol/L,Loucy IC50=11.57μmol/L,MOLT-4 IC50=8.79μmol/L,P12-ICH IC50=29.49μmol/L。所有T-ALL细胞对BI-3406不敏感,而与之药理作用相同的BAY-293促进细胞凋亡(可能存在其它作用),二者均不是治疗T-ALL的有效RAS抑制剂。结论:表明RAS在大多数T-ALL细胞株生存中扮演主要促进作用。对T-ALL细胞有效的RAS抑制剂难以选用,抑制RAS活性也会促进细胞凋亡,影响T-ALL细胞株的体外生存。第三部分敲低KRAS表达对T-ALL细胞株体外生存的影响目的:验证RAS蛋白家族在维持T-ALL细胞株体外生长中的功能。方法:利用分子克隆实验,构建靶向KRAS基因编码区siRNA表达逆转录质粒;将siRNA克隆到pSEH-361载体,应用pAMPHO与pVSVG质粒在HEK-293T细胞中,包装逆转录病毒,感染T-ALL细胞株,构建敲低KRAS基因表达的P12-ICH、Jurkat、HPB-ALL细胞株。使用qRT-PCR和Western blot检测基因的表达情况;使用Annexin V-PE/7-AAD染色,流式细胞术检测细胞的凋亡状况;使用Hoechst33258染色,流式细胞术检测细胞的周期状况;使用抗体染色,荧光显微镜观察caspase 3蛋白的表达。结果:成功构建靶向KRAS基因编码区siRNA表达逆转录质粒和P12-ICH-siKRAS、Jurkat-siKRAS和HPB-ALL-siKRAS细胞株;流式细胞术检测结果显示抑制KRAS表达后3种细胞株均发生不同程度的凋亡,细胞生存率分别为P12-ICH-siKRAS=(56.73±3.07)%,Jurkat-siKRAS=(70.00±1.93)%,HPB-ALL-siKRAS=(55.20±3.40)%。免疫荧光实验显示抑制KRAS表达后凋亡相关蛋白caspase 3在3种细胞株中的表达均明显增加;细胞周期结果显示抑制KRAS表达后3种细胞株均发生G0/G1期延长的周期阻滞。结论:抑制KRAS表达,T-ALL细胞株凋亡明显,细胞周期阻滞。KRAS蛋白激活维持T-ALL细胞生存,促进其在体外生长。