目的：血友病（hemophilia）是一种常见的出血性疾病，主要是由于凝血活酶缺失导致，其中最为常见的是甲型血友病(HemophiliaA，HA)。甲型血友病是一种X连锁的隐性遗传病，约占先天性出血性疾病的85%，在男性活婴的发病率约为1／5000，女性主要为携带者，患者少见。编码凝血因子Ⅷ的基因发生突变而导致的该凝血因子功能缺陷或含量不足是该病发生的主要原因。临床表现为自幼反复自发或轻微创伤后全身各部的出血，除皮肤、粘膜出血外，以肌肉、关节出血为特点，反复关节出血往往导致关节畸形，重要脏器出血甚至可危及生命。HA的发病轻重主要与FⅧ活性大小有关，FⅧ活性<1%为重型，FⅧ活性在1%到5%之间为中型，5%到25%之间为轻型，还有一部分定义为亚临床型，其FⅧ活性在25%到45%之间。目前只能靠替代疗法、对症处理等来维持患者的生命，临床上没有找到有效的根治性治疗措施,因此对有生育要求的可疑携带者进行基因诊断，筛查出携带者进行产前诊断，从而降低血友病患儿的出生率是目前针对HA最行之有效的办法。通过产前诊断对胎儿进行甲型血友病的诊断，主要是在风险胎儿的性别诊断的前提下，对男性胎儿进行基因诊断，对女性胎儿进行携带者基因的诊断。对脐带血的凝血因子FⅧ抗原缺乏的测定也可以作为对高危胎儿的筛查方法，但是目前该方法还有待研究，不能作为确诊依据。研究证实，内含子22倒位是导致重型甲型血友病的一种重要的突变类型，其中，约有近30%~40%的重型HA是由内含子22倒位引起，而内含子1倒位作为近年来发现的导致重型HA的另一个突变热点，也占到了重型HA的5%左右。通过基因诊断，先确定是否存在内含子22倒位或者内含子1倒位这两种常见的导致HA的突变热点，在排除这两种倒位之后再进行测序检测，全面筛查FⅧ的全部基因序列，找到问题位点。本次实验对甲型血友病患者进行FⅧ活性测定（coagulation factor Ⅷactivity，FⅧ:C），确定是否属于重型患者。对患者进行FⅧ基因内含子22倒位检测及内含子1倒位分析检测。对存在内含子22倒位的患者的FⅧ基因进行测序分析，探索是否存在其他突变。通过实验，找到针对甲型血友病的一套直接基因诊断方法，并分析这套方法的研究对HA控制的临床意义。方法：采用国际通用一期法对33例甲型血友病患者进行FⅧ活性测定（coagulation factor Ⅷ activity，FⅧ:C），根据FⅧ:C测定结果对所有患者进行甲型血友病的分型。采用LD-PCR方法进行FⅧ内含子22倒位检测，应用凝胶成像技术对扩增产物进行分析，找到倒位患者，分析改组患者的倒位发生率，期间对反应体系及反应条件进行优化；采用双管多重PCR技术对其中重型HA患者进行内含子1倒位检测，凝胶成像技术分析扩增产物。对发现内含子22倒位的患者应用捕获测序技术检测是否存在其他突变类型。结果：应用一期法对33例甲型血友病患者进行FⅧ活性检测，检测结果显示该组患者的FⅧ活性均小于1%，根据临床分型证实均为重型甲型血友病，重型HA的发生率在改组人群中为100%；通过LD-PCR技术检测33例重型HA患者中有13例存在Int22倒位，倒位的发生率为39.4%（13/33）；通过多重PCR技术检测33例重型HA患者中存在Int1倒位患者1人，发生率为3%（1/33）；对LD-PCR技术检测出的13例存在内含子22倒位的患者进行测序比对，未发现其它基因突变。结论：血友病种类繁多，FⅧ活性检测是目前确诊甲型血友病的有效方法。内含子22倒位和内含子1倒位是现如今发现的导致重型HA的两大重要发病机制。基因诊断最好是在通过FⅧ活性检测确诊为甲型血友病并进行临床分型后进行，诊断时首先进行内含子22及内含子1倒位检测，在排除倒位后再进行测序检测，可以降低检测成本。内含子1倒位通过多重PCR技术检测就可以有效的检测出，且检测方法简单易行，便于临床推广。LD-PCR技术检测内含子22倒位，具有时间短、准确率高，不需要操作放射性同位素等优点，优于Southern印迹杂交法等传统技术，便于临床应用。