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荧光酶免疫分析技术(Fluorescent-Enzyme immunoassay, FEIA)是在酶联免疫分析技术(ELISA)基础之上,通过测定酶催化的荧光底物发出的荧光强度而建立起来的更为灵敏的检测体内微量物质的一种方法,本实验将应用此项技术建立定量检测人甲状腺过氧化物酶抗体(human Thyroid Peroxidase autoantibody,hTPOAb)的方法,为自身免疫性甲状腺疾病(Autoimmune Thyroid Disease, AITD)的诊断提供依据。目的：利用分子生物学方法在原核系统表达hTPO抗原决定簇片段,以基因工程产品为抗原,建立定量检测hTPOAb的FEIA,并用于临床作为AITD的诊断、鉴别诊断和疗效监测手段。方法：在表达菌株E.Coli BL21中诱导表达含有本室构建的hTPO抗原决定簇“热点”区基因(1702-2622,编号相对于起始密码,编码AA568-874)的重组表达质粒pGESJ,经纯化获得GST-hTPO(谷胱甘肽巯基转移酶-人甲状腺过氧化物酶)融合蛋白,并对其进行分子量和免疫活性鉴定。以重组融合蛋白GST-hTPO为抗原包被96孔透明板,样品血清中hTPOAb为一抗,碱磷酶标记的羊抗人IgG为二抗,4-MUP(4-甲基磷酸伞形酮)为荧光底物建立了板式FEIA,利用经国内标准品校正的本室标准物建立标准曲线以实现本法的定量检测,并对本法的特异性、精密度、准确度、健全性等进行了方法学鉴定。用该法测定262例正常人,五类甲状腺疾病患者534例,包括Graves’病(GD)270例,桥本氏病(HT)166例,单纯甲肿43例,亚甲炎38例,腺瘤17例。结果：1.GST-TPO融合蛋白的表达、纯化及鉴定以E. Coli BL21为表达菌株,以IPTG(isopropylβ-D-thoiglactoside,异丙基β-D-硫代半乳糖苷)为诱导剂,浓度0.1mM,25℃诱导5.5小时,产物经Glutathione Sepharose 4B(谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B)亲和层析纯化后,使用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳)测定GST-hTPO分子量结果为61.24KD,经考马斯亮蓝染色法定量获得融合蛋白表达产率为12mg/L培养基,FEIA结果证明GST-hTPO具有良好免疫活性。将包被GST-hTPO并封闭的透明板条冻存于-80℃冰箱,以ELISA进行6个月的观察,得到阴性、阳性批间变异系数分别为12.30%和6.78%。2.以融合蛋白为抗原建立定量荧光发光酶免疫分析技术并进行方法学鉴定反应条件的优化：按交叉连续稀释法组合包被抗原量,人血清稀释倍数,二抗稀释倍数,结果在不同条件组合中当包被抗原量为1μg/孔,人血清稀释倍数为1：100,二抗稀释倍数为1：20000时,37℃温育60分钟时阳性血清与阴性血清的差距可达到10倍,故选作最佳条件。最后加入终止液EDTA反应达到平衡后测量。确定的标准曲线六个点的浓度分别为180 IU/ml,100 IU/ml,17 IU/ml,6 IU/ml,3 IU/ml及2IU/ml。方法学鉴定,特异性：该融合蛋白与甲状腺球蛋白抗体无交叉反应；精密度：取阳性、阴性对照血清各六孔测定得到批内变异分别为5.14%、19.36%,两个月内测定六次阳性、阴性对照血清得到批间变异分别为6.72%、17.90%；准确度：测定高、中、低样品回收率分别为102%、92%、100%；健全性：将一份HT患者血清分别进行两次对倍稀释,以测定的三个浓度值绘制成稀释曲线,得到的稀释曲线与标准曲线基本平行；相关性：将本法与雅培公司AXSYM System hTPOAb试剂盒共同检测61份血清,结果显著相关R=0.80,P<0.01。3.临床应用经测定262例健康人血清,得到hTPOAb阳性切线值为5IU/mL。用此方法测定病人血清hTPOAb,测定甲状腺疾病患者hTPOAb以中位数表示,HT为11.5IU/ml,阳性率89.76%；GD治疗前是4IU/ml,阳性率32.35%；GD治疗后是4IU/ml,阳性率31.68%；亚甲炎组为4IU/ml,阳性率26.32%：单纯甲肿为3IU/ml,阳性率为0；腺瘤为4IU/ml,阳性率11.76%。HT患者血清hTPOAb阳性率与其它各组有显著差异(p<0.01)。结论1hTPO在E.coli BL21中高效表达,并具有与hTPOAb结合的免疫活性,产率可达12mg/L培养基。2本实验成功地制备了hTPOAb的标准品,并建立了以重组hTPO为抗原、以96孔板为固相载体的定量检测hTPOAb的FEIA。本方法具有良好的特异性、精密度、准确性、可靠性,与雅培测定hTPOAb试剂盒有良好的相关性。3该定量检测hTPOAb的FEIA应用于临床甲状腺疾病患者的血清学检查,结果显示桥本氏甲状腺炎有很高的阳性率,故可作为桥本氏甲状腺炎的特异性诊断手段,其对于AITD与非AITD的鉴别诊断也具有重要的临床意义。