目的：前期研究发现，淡豆豉(Semen Sojae Preparatum)能纠正去卵巢骨质疏松大鼠骨形态计量学参数的异常，改善骨的微细结构及骨生物力学性能，提高骨密度，有明显的抗骨质疏松活性，但其作用机制尚不十分清楚。为明确淡豆豉抗骨质疏松作用的靶点和途径，本研究以淡豆豉的主要活性部位淡豆豉异黄酮(Semen Sojae Preparatum Isoflavone，SSPI)为研究对象，采用体外培养大鼠成骨细胞的方法，从细胞及分子等不同水平观察其对成骨细胞的影响，旨在从雌激素受体途径探讨其防治骨质疏松症的作用机制，为扩大淡豆豉临床应用及筛选抗骨质疏松新药提供实验依据。　　方法：　　1淡豆豉异黄酮对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响　　1.1大鼠颅骨成骨细胞(OB)原代培养与鉴定　　采用改良的组织块法分离培养新生(24 h)SD大鼠颅骨成骨细胞。用碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞，倒置显微镜下观察细胞形态及ALP染色阳性率。　　1.2淡豆豉异黄酮对体外培养OB的细胞毒性检测　　SSPI浓度梯度设定为1、100、1000、5000、10000、50000、100000、500000μg/L，作用时间为24 h；MTT法测定各孔的存活率，以OD值表示。　　1.3淡豆豉异黄酮作用浓度及时间确定　　SSPI干预浓度为如下梯度：1、10、50、100、200、500、1000、5000、10000、50000、100000μg/L，分别作用24 h，48 h，72 h；MTT法进行测定，确定其促增殖的最佳作用浓度与时间。　　1.4淡豆豉异黄酮对成骨细胞增值与分化的影响　　实验分为空白对照组(control)，淡豆豉异黄酮组(SSPI)：1、10、100、1000μg/L，雌二醇组E2(10-9mol/L)，大豆异黄酮组(ISO)：1000μg/L，并设立雌激素受体拮抗剂ICI182780组，即淡豆豉异黄酮SSPI(1000μg/L)+ICI182780(10-8mol/L)，以初步观察SSPI是否通过雌激素受体途径对成骨细胞进行调控。且ICI182780于淡豆豉异黄酮干预前2 h进行孵育。作用时间分别为48 h和72 h。　　1.4.1 MTT法检测成骨细胞增殖情况　　采用噻唑蓝比色(MTT)法，检测淡豆豉异黄酮24 h，48 h，72 h对大鼠成骨细胞增殖功能的影响。　　1.4.2成骨细胞碱性磷酸酶活性检测　　采用碱性磷酸酶测定试剂盒，测定淡豆豉异黄酮48 h和72 h成骨细胞ALP活性，检测其对大鼠成骨细胞早期分化的影响。　　1.4.3成骨细胞羟脯氨酸含量的测定　　采用消化法，测定淡豆豉异黄酮48 h和72 h成骨细胞内羟脯氨酸含量，检测其对成骨细胞胶原蛋白含量的影响。　　2淡豆豉异黄酮对大鼠成骨细胞雌激素受体(Estrogen Receptor，ER)表达的影响　　2.1不同浓度SSPI对成骨细胞ERα、ERβ mRNA表达水平的影响　　实验分为空白对照组，淡豆豉异黄酮1、10、100、1000μg/L不同浓度组。作用72 h。Trizol法提取细胞总RNA，RT-PCR法测定不同浓度SSPI干预后成骨细胞ERα、ERβ mRNA的表达。　　2.2 SSPI与ISO对成骨细胞ERα、ERβ mRNA表达水平的比较　　实验分为空白对照组，淡豆豉异黄酮组(SSPI1000μg/L)，雌二醇组E2(10-9 mol/L)，大豆异黄酮组(ISO1000μg/L)，并设立雌激素受体拮抗剂组，即淡豆豉异黄酮SSPI(1000μg/L)+ICI182780(10-8mol/L)，且ICI182780于SSPI干预前2 h进行孵育。作用72 h。Trizol法提取细胞总RNA，RT-PCR法测定各药物干预后成骨细胞ERα、ERβ mRNA的表达。　　2.3不同浓度SSPI对成骨细胞ERα、ERβ蛋白表达的影响　　实验分组及药物干预同2.1。RIPA裂解液提取细胞总蛋白，Western blot法检测ERα、ERβ蛋白表达水平。　　2.4 SSPI与ISO对成骨细胞ERα、ERβ蛋白表达水平的比较　　实验分组及药物干预同2.2。RIPA裂解液提取细胞总蛋白，Westernblot法检测ERα、ERβ蛋白表达水平。　　结果：　　1淡豆豉异黄酮对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响　　1.1成骨细胞形态观察　　倒置相差显微镜下，原代培养24 h～36 h即可见成骨细胞自颅骨碎片移出，未贴壁的为小球形，呈悬浮状态，贴壁的呈短梭形或三角形，以骨块为中心，向周围呈放射生长，细胞排列无方向性。传代细胞最初接种时呈球形，悬浮于培养液中；24 h可见大部分细胞贴壁、伸展，初时细胞形状不规则，呈多边形、三角形等。培养3 d后，OB形状基本稳定，呈纤维束状、长梭形、条索状，细胞相互之间联系密切，融合成片，分界较为模糊。培养5d左右细胞呈铺路石状。随着培养时间的延长，细胞逐渐聚集形成细胞小结。　　1.2成骨细胞的鉴定　　碱性磷酸酶染色：实验用成骨细胞染色后显微镜下可见细胞内散在的紫蓝色沉淀，呈典型的ALP染色阳性反应。细胞染色深浅不等，阳性细胞多为长梭形和鳞片形，成骨细胞碱性磷酸酶染色阳性率达93％。　　1.3淡豆豉异黄酮的细胞毒作用　　淡豆豉异黄酮浓度达到50000μg/L时，OD值较空白对照组显著降低(P＜0.01)，多数细胞皱缩成球形、少数死亡细胞漂浮在孔中。提示SSPI浓度大于50000μg/L时，出现明显细胞毒作用。　　1.4淡豆豉异黄酮作用浓度及时间确定　　不同浓度淡豆豉异黄酮干预细胞对OB的增殖产生了不同程度的促进作用，根据MTT结果分析确定SSPI作用浓度为1、10、100、1000μg/L；作用时间为48 h和72 h。　　1.5淡豆豉异黄酮对成骨细胞增殖功能的影响　　与空白对照组比较，除ICI182780组，各组药物在干预48 h或72 h后OD值均显著升高(P＜0.05)。SSPI干预效应随着干预时间的延长而增加(P＜0.05)，随着浓度的改变无明显的变化(P＞0.05)，以SSPI1000μg/L组72 h作用最强，高于ISO组，且可被ICI182780所拮抗。　　1.6淡豆豉异黄酮对成骨细胞分化的影响　　与空白对照组比较，除ICI182780组，各组药物在干预48 h或72 h后均增加细胞内ALP活性。不同浓度的SSPI组与E2比较无显著差异(P＞0.05)，其中以SSPI1μg/L组最强(P＜0.05)，其次为ISO组(P＜0.05)。ICI182780组与空白对照组比较，无显著性差异，与SSPI1000μg/L组比较OD值有降低趋势，但无显著性差异(P＞0.05)。　　1.7淡豆豉异黄酮对成骨细胞羟脯氨酸含量的影响　　与空白对照组比较，除ICI182780组，各组药物在干预48 h或72 h后均增加细胞内羟脯氨酸的含量。SSPI1000μg/L较之10-9mol/L雌二醇作用无显著差异(P＞0.05)，高于同剂量ISO组。且可被ICI182780所拮抗。不同浓度的SSPI组与雌二醇比较无显著差异(P＞0.05)。　　2淡豆豉异黄酮对大鼠成骨细胞雌激素受体表达的影响　　2.1不同浓度SSPI对成骨细胞ERα、ERβ mRNA表达的影响　　与空白对照组相比，不同浓度SSPI均上调ERβ mRNA表达(P＜0.01)；其中SSPI1000μg/L表达最高，其次为SSPI10μg/L，其余两组组间无差异(P＞0.05)。实验未检测到ERα mRNA的表达。　　2.2 SSPI与ISO对成骨细胞ERα、ERβ mRNA表达水平的比较　　与空白对照组相比，SSPI(1000μg/L)，E2(10-9mol/L)ERβ mRNA表达显著升高(P＜0.01)；ISO(1000μg/L)组ERβ mRNA有升高趋势，但无统计学差异(P＞0.05)；SSPI作用弱于E2，且可被ICI182780所拮抗。实验未检测到ERα mRNA的表达。　　2.3不同浓度SSPI对成骨细胞ERα、ERβ蛋白表达的影响　　不同浓度SSPI组ERβ蛋白表达较空白组均升高(P＜0.01)，其中SSPI1000μg/L表达最高；SSPI1、10、100μg/L三组组间无统计学差异(P＞0.05)。结果显示SSPI对成骨细胞ERβ蛋白表达无明显剂量依懒关系。实验未检测到ERα蛋白的表达。　　2.4 SSPI与ISO对成骨细胞ERα、ERβ蛋白表达水平的比较　　与空白对照组相比，SSPI1000μg/L，E2(10-9mol/L)，ISO1000μg/L组ERβ蛋白表达均显著升高(P＜0.01或P＜0.05)；SSPI1000μg/L作用最显著，高于同剂量ISO组，且可被ICI182780所拮抗。实验未检测到ERα蛋白的表达。　　结论：　　1淡豆豉异黄酮(1～1000μg/L)可显著促进成骨细胞的增殖、分化以及骨基质形成，其中1000μg/L作用最显著，且该效应可被雌激素受体拮抗剂ICI182780所拮抗，提示SSPI可能通过雌激素受体途径调控成骨细胞的增殖和分化。　　2淡豆豉异黄酮可上调成骨细胞中ERβ mRNA和ERβ蛋白的表达水平，但对ERα无明显作用，推测ERβ是成骨细胞表达的主要ER亚型，在成骨细胞中SSPI可能通过ERβ途径发挥雌激素样作用防治骨质疏松。　　3淡豆豉异黄酮对成骨细胞增殖、分化与骨基质形成的促进作用以及上调成骨细胞ER表达等方面均优于大豆异黄酮，显示淡豆豉可能比大豆具有更强的抗骨质疏松活性。