论文部分内容阅读
据世界卫生组织预测,21世纪由于全球变暖,环境污染,人们的生活节奏加快,疾病流行等因素,不孕不育将成为仅次于肿瘤和心脑血管疾病的第三大类疾病。雌性不育病因复杂多样,涉及环境和基因双重原因。近年来迅速发展的基因敲除或转基因技术为雌性不育的病理机制揭示提供了强有力手段,为不孕不育的治疗提供了新的可能的诊断和治疗靶点。NRAGE 属于黑色素瘤抗原基因(Melanoma antigen-encoding gene,MAGE)家族成员之一,该基因定位于X染色体。前期大量文献表明,NRAGE基因在细胞凋亡[1]、细胞周期、细胞生长[2]等过程中发挥着重要的调节作用,而对于NRAGE在雌性生殖系统方面的研究,相关的报道甚少。但是,已有文献研究表明,生物钟基因在卵巢卵泡发育进程中发挥重要功能[3],而NRAGE属于生物钟基因[4],提示NRAGE在卵巢卵泡发育中具有重要作用。此外,最重要的是,我们在饲养小鼠过程中发现,在同样的饲养环境下,NRAGE基因敲除纯合雌鼠不育,杂合雌鼠生殖力严重低下,而野生型雌鼠则具有正常生殖能力。因此,基于上述研究背景,我们主要利用基因敲除杂合雌鼠(纯合雌鼠极难得)研究了 NRAGE基因敲除对雌鼠生殖功能的影响。论文主要实验内容和结果如下:1.明确NRAGE在野生型雌鼠性腺轴(下丘脑、垂体和卵巢)中的表达情况通过RT-PCR及qPCR实验,发现NRAGE在下丘脑、垂体和卵巢中出现高表达,其表达量甚至远高于NRAGE在大脑皮层的表达(已有文献报道,NRAGE在大脑皮层高表达)。同时,该基因在输卵管和子宫也表达丰富,其表达量明显高于其他组织(如心脏、肝脏和脾脏等组织)。Western blot检测结果支持了 qPCR的结果。免疫组化进一步检测了 NRAGE在卵巢中的表达定位,发现该基因主要在卵母细胞、卵泡膜细胞、间质细胞中高表达,在颗粒细胞中也检测到一定的表达,但表达量要弱于上述细胞类型。2.生殖竞争及生育力实验,小鼠阴道开口时间、动情周期以及小鼠血清激素E2、FSH、LH的检测为进一步明确NRAGE敲除对雌性生殖的影响,我们利用5对野生小鼠和杂合敲除小鼠进行了生殖竞争和生育力实验。结果发现,40%杂合小鼠完全不育,且不育小鼠的体重明显轻于对照组(NRAGE+/-:16.93±0.13vs.NRAGE+/+:28.18±0.64,p<0.001)。可育杂合小鼠与野生小鼠相比较,其首次生产育龄有延长趋势;在平均产仔数、存活率方面,可育杂合小鼠存在下降趋势。另外,杂合小鼠生产窝数明显低于正常组(NRAGE+/-:2.0±1.87vs.NRAGE+/+:4.75士0.96,p<0.05)。鉴于NRAGE基因敲除杂合雌鼠存在生殖力低下表型,我们检测了杂合小鼠的阴道开口时间、动情周期和血清激素的水平。结果发现:杂合小鼠阴道开口时间明显延迟(NRAGE+/-:40.86±8.25 天 vs.NRAGE+/+:33.74±4.84 天,p<0.05),杂合小鼠动情期明显缩短(NRAGE+/-:11.90±14.36%vs.NRAGE+/+:38.10 ±6.73%),而间期明显延长(NRAGE+/-:25.40±12.7%vs.NRAGE+/+:20.95±7.22%,p>0.05),其动情周期运行不规律性。检测杂合小鼠血清激素E2、FSH、LH发现,上述激素在野生小鼠和杂合小鼠中并无明显差异。3.卵巢、子宫的形态学观察及卵泡计数鉴于NRAGE基因敲除杂合小鼠内分泌激素正常,于是我们分析了杂合小鼠卵巢、子宫形态。结果发现:与野生雌鼠相比,4周龄杂合鼠在卵巢、子宫形态学方面及卵泡计数并无差异(n=2)。但是比较6月龄小鼠发现,杂合鼠表型差异较大,其中50%完全不育,且完全不育雌鼠体型小,体重轻,卵巢和子宫明显发育不全。可育杂合雌鼠则在体型体重,卵巢子宫表型方面并无明显差异,但卵泡计数发现有腔卵泡明显减少(NRAGE+/-:0.28±0.20 vs.NRAGE+/+:0.80±0.26,p<0.01)。4.超排卵实验为进一步探究小鼠生殖力低下的原因是否由于排卵障碍所引起,本实验对4周龄小鼠(n=5)进行超排卵实验。结果发现,与野生型小鼠相比,杂合雌鼠对外源激素反应低下,排卵数目明显减少(NRAGE+/-:16.4±5.77 vs.NRAGE+/+:28.6±9.24,p<0.05)。对排卵后的卵巢进行HE染色发现,杂合小鼠卵巢小,有腔卵泡明显减少(NRAGE+/-:0.28±0.05 vs.NRAGE+/+:0.62±0.19,p<0.05)。对子宫内膜分析发现,子宫对外源激素反应低下,子宫内膜较薄。5.TUNEL 实验因杂合小鼠卵巢切片中有腔卵泡数目下降,本实验拟通过TUNEL实验检测该数目下降是否由于NRAGE敲除导致凋亡能力提高所致。结果发现,无论是4周龄还是6月龄小鼠,杂合型卵泡凋亡能力并没有明显改变。主要结论:1.NRAGE基因在雌性性腺轴中呈高表达。2.NRAGE杂合小鼠表现出生育力降低表型,40%完全不育,可育杂合小鼠首次生产育龄有延长趋势,产仔窝数减少;另外,杂合小鼠动情周期紊乱,阴道开口时间延长,卵巢中有腔卵泡明显减少,其生产窝数明显低于对照组。3.NRAGE基因敲除杂合小鼠对促性腺激素的反应能力差,表现为排卵数目减少,子宫壁薄。