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第一部分糖基化终产物对胰岛星状细胞活化及胰岛β细胞的损伤背景和目的:糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)是长期高血糖产生的氧化衍生物,被视为胰岛β细胞损伤、外周IR和糖尿病的潜在风险。既往研究已经证实AGEs对胰岛β细胞有直接损伤作用,随着细胞间交互作用(crosstalk)研究的深入,为明确AGEs是否会对胰岛内的间质细胞—胰岛星状细胞(islet stellate cell,ISC)产生活化作用,并且在活化过程中损伤胰岛β细胞功能,我们通过体外实验来观察AGEs对ISC作用的同时,对β细胞功能、活力、凋亡的影响。方法:1、用牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和葡萄糖37°C孵育三个月制备AGEs。2、分离6-8周龄SD大鼠胰岛,培养ISC。200 mg/L AGEs和同浓度BSA分别干预ISC,普通显微镜下观察细胞外爬速率,油红O染色动态观察星状细胞胞浆内脂肪小滴消失速率,CCK8检测细胞增殖活力,划痕实验观察细胞迁移能力,qPCR测定活化标志物平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)组份I型胶原蛋白(collagen typeⅠ,ColⅠ)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的mRNA表达。3、收集AGEs干预静息态ISC(quiescent ISC,qISC)的两部分上清,分别干预INS-1细胞。高K刺激胰岛素分泌实验(K~+stimulates insulin secretion,KSIS)检测INS-1细胞分泌胰岛素功能,CCK8检测细胞活力,细胞荧光TUNEL实验观察细胞凋亡,qPCR检测CHOP(C/EBP homologous protein)mRNA表达,观察细胞内质网应激水平。结果:1、大鼠胰岛分离后贴壁48小时,可见少许ISC外生。AGEs培养环境中,ISC的外生速率较BSA培养环境中的ISC明显加快。油红O染色显示AGEs培养环境中的ISC胞浆内脂肪小滴消失速率较BSA培养的ISC明显加速,同时AGEs培养环境中ISC在96小时后细胞胞浆内脂肪小滴完全消失。CCK8实验结果显示AGEs干预后的ISC活力在48小时时较对照组明显增加。划痕实验显示AGEs培养环境中的ISC迁移能力快于BSA培养环境中的ISC。qPCR显示AGEs培养环境中ISC的α-SMA表达明显增加,同时细胞外基质组份ColⅠ、FN表达高于BSA培养环境中的ISC。2、AGEs干预qISC的上清干预INS-1细胞48小时后,INS-1细胞的胰岛素分泌功能较对照组显著下降。qPCR结果显示实验组INS1和INS2的mRNA表达均低于对照组。CCK8结果显示,INS-1细胞活力被抑制。TUNEL实验显示实验组INS-1细胞出现凋亡,而对照组均未出现细胞凋亡。同时,实验组的CHOP mRNA表达较对照组明显增高。结论:我们的研究证实:1、AGEs通过促进ISC的外生、增殖、迁移、合成和产生过多的ECM,促进了ISC的活化。2、AGEs干预ISC的上清抑制INS-1细胞合成、分泌胰岛素的功能,抑制INS-1细胞活力,促进细胞凋亡;其作用机制可能是触发了INS-1细胞内质网应激。第二部分血清糖基化终产物肽和胰岛功能的相关性研究背景和目的:体外细胞实验已经证实AGEs可以直接或间接损伤胰岛β细胞功能。体内血循环中的高AGEs是否也是胰岛β细胞功能受损的危险因素?由于检测方法的限制,目前文献报道尚无定论。基于本课题组前期证实流动注射分析法检测AGEs-P和血清AGEs的高度相关性,我们通过评估人群中血清AGEs-P和胰岛β细胞功能来观察二者之间的关联。方法:依托于国家重点研发计划“重大慢性非传染性疾病防控研究”二阶段中江苏省盐城市流行病学调查数据进行随机抽样,测定空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、OGTT 2小时血糖(2-hour postprandial glucose,2h-PG)、糖化血红蛋白(Hb A1c)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein,LDL)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cre)、尿酸(uric acid,UC)等,流动注射法检测血清AGEs-P,用HOMA稳态模型计算胰岛β细胞功能(HOMA-β)、胰岛素抵抗(HOMA-IR),进行Pearson相关性分析,并用多元线性回归校正潜在混杂因素的影响,探讨AGEs-P和HOMA-β的关联。结果:1、本研究共纳入391例研究对象,其中糖尿病(diabetes mellitus,DM)126人,糖调节受损(impaired glucose regulation,IGR)132人,正常糖调节(normal glucose regulation,NGR)133人。2、DM组的SBP、FPG、2h-PG、Hb A1c、AGEs-P、HOMA-IR、TC、TG、腰臀比(waist-to-hip ratio,WHR)、心率均显著高于NGR组和IGR组,HOMA-β显著低于其他两组(P<0.05)。3、AGEs-P和FPG、2h-PG、Hb A1c、HOMA-IR呈现显著正相关(P<0.05),和HOMA-β呈现显著负相关(P值为0.025)。4、HOMA-β和性别、FINS、HOMA-IR呈现显著正相关,和年龄、AGEs-P、FPG、2h-PG、Hb A1c、心率、收缩压(systolic pressure,SBP)、体重指数(body mass index,BMI)、WHR呈现显著负相关(P<0.05)。5、进一步校正混杂因素对HOMA-β的影响,包括年龄、性别、SBP、BMI、TC、TG、HDL、BUN、Cre、UA,AGEs-P是HOMA-β的独立危险因素(P值为0.031);但当模型中纳入FPG后,AGEs和HOMA-β的关系不再显著(P值为0.646)。结论:我们的研究证实,人体血清AGEs-P和FPG、2h-PG、Hb A1c、HOMA-IR、HOMA-β均有显著的相关性;同时AGEs-P是胰岛β细胞功能损伤的独立危险因素,但其对胰岛β细胞功能的影响不独立于血糖存在。