论文部分内容阅读
目的1.选择2型糖尿病(T2DM)、T2DM合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者及体检正常人群为研究对象,观察不同人群空腹血浆visfatin水平变化,初步探讨visfatin与T2DM合并NAFLD的关系,为临床诊治NAFLD提供实验基础和理论依据。2.体外培养正常人肝细胞HL-7702细胞系；观察visfatin对HL-7702细胞系增殖的影响；研究visfatin影响正常人肝细胞的作用机制,为visfatin伺效的降低血糖、减轻胰岛素抵抗、改善NAFLD等临床治疗提供初步的理论依据.方法1.采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测了T2DM合并NAFLD组(A组)、T2DM不合并NAFLD组(B组)以及正常对照组的血浆visfatin水平,同时测定各组的血糖、血脂、糖化血红蛋白、胰岛素等生化指标,计算腰臀比(WHR)、体质量指数(BMI)、稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),分析各组visfatin与其他检测指标的关系；2.体外培养正常人肝细胞,通过倒置显微镜形态学观察。3.将培养的正常人肝细胞随机分为5组：对照组,visfatin(50ng/mL)组,visfatin(100ng/mL)组,visfatin(250ng/mL)组,visfatin(500ng/mL)组,每组设5个复孑L,分别干预24、48小时(h)。观察各组细胞的形态学变化,并用MTT法检测不同浓度的visfatin干预48小时对细胞存活数量和活力的影响,分析不同浓度的visfatin对肝细胞生长的影响。4.将培养的肝细胞随机分为5组：对照组,visfatin(50ng/mL)组,visfatin(100ng/mL)组, visfatin(250ng/mL)组,visfatin(500ng/mL)组,分别干预1h、6h、12h、24h、48h。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组细胞裂解液中磷脂酰肌醇3一激酶(P13K)、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMPK)、磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(PEPCK)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的蛋白表达情况。结果1.A组与B组比较,收缩压、体重、腰围、BMI、WHR、TC、TG、LDL HDL、HbA1c差异均无统计学意义(均P>0.05),但均高于正常对照组(均P<0.01)；A组的FBG、餐后2小时血糖(P2hBG)、FIns、HOMA-IR、visfatin差异均显著高于B组(P<0.01)。2.直线相关分析显示,120例T2DM患者的血浆visfatin水平与HOMA-IR、Fins、FBG、P2hBG、BMI、LDL呈正相关(r分别为0.886、0.708、0.706、0.492、0.234、0.213,P<0.05)；与HDL呈负相关(r|为-0.206)；与HbA1c、TG、TC、体重、WHR、SBP、DBP无相关性(P>0.05)。Logistic回归分析表明visfatin、FBG是影响T2DM患者是否发生NAFLD的影响因素。由ROC曲线得到的visfatin预测NAFLD的临界值(cut off值)5.175ng/ml,灵敏度为98.2%,特异度为39.1%,OR值为36.84。3.正常人肝细胞HL-7702的传代培养情况良好。MTT结果表明：不同visfatin浓度干预HL-7702细胞系,在24h、48h时对细胞的生长均无明显影响。4ELISA结果：(1)浓度变化趋势：visfatin的干预对PI3K、pAMPK、PEPCK的影响呈现浓度依赖性,PI3K、pAMPK的表达随着visfaitn干预浓度的增加而增加,PEPCK的表达随着visfatin浓度的增加而降低；ACC的表达量随着visfatin干预浓度的变化表现出波动性变化,较高浓度浓度的visfatin对ACC表达无影响,而较低浓度的visfatin刺激ACC的表达。(2)时间变化趋势：PI3K、pAMPK表达的时间变化趋势较为一致,在干预1h达到第一个高峰,随后下降,从6h到12h又呈现缓慢上升趋势,12h至24h升高明显,达第二个高峰,随后又逐渐下降。PEPCK的表达则与PI3K、pAMPK的表达相反,并且干预各时间点PEPCK的表达均较对照明显降低。ACC的表达因干预浓度的不同表现出不同的变化趋势,50ng/ml visfatin干预组、100ng/mlvisfatin干预组在各时间点都是促进ACC表达的,250ng/ml visfatin干预组、500ng/ml visfatin干预组随着时间的变化以对照组为基线上下波动。结论1.本研究通过整体水平的研究,发现单纯T2DM患者和T2DM合并NAFLD患者的血浆visfatin浓度较正常人群明显升高,visfatin与HOMA-IR正相关,并且Logistic回归证实visfatin是影响NAFLD是否发生的因素,证明visfatin通过某些机制在T2DM及NAFLD的发生发展中起重要作用。2.体外实验证实visfatin可以影响PI3K和pAMPK的表达,visfatin促进PI3K和pAMPK的表达,并呈现剂量依赖性；PEPCK的变化与PI3K和pAMPK相反,即visfatin抑制PEPCK的表达, ACC的变化表现为较低浓度的visfatin刺激使ACC的表达。