牛结核病是一种人兽共患传染病,其主要病原为牛分支杆菌（Mycobacterium bovis,M.bovis）。由于缺乏高效疫苗,牛结核病在没有足够资金支持的发展中国家仍未得到有效防控。天然抗性相关性巨噬细胞蛋白1（Natural resistance-associated macrophage protein 1,NRAMP1）基因对巨噬细胞激活通路具有多效性作用,并可抑制多种胞内寄生菌的感染,其表达水平影响着机体对于M.bovis的抵抗力。因此,通过转基因的方法提高牛体内NRAMP1基因的表达量将为牛结核病的防控提供一种新途径。实验室首次利用规则成簇间隔短回文重复序列相关蛋白9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CPISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9）基因编辑系统结合体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）技术培育出NRAMP1基因定点整合在ROSA26基因座的克隆牛。本研究以所生产的3头转NRAMP1基因克隆牛为试验材料,对其进行分子鉴定及抗结核功能检测,以证明转NRAMP1基因克隆牛可用于进一步的转基因生物安全评价及良种扩繁。本研究主要内容如下:1.NRAMP1转基因牛精准打靶检测。采集转基因荷斯坦犊牛的耳组织,通过组织块贴壁法分离培养出小牛成纤维细胞;提取小牛成纤维细胞基因组后,通过Junction PCR和Sanger测序检测出3头转NRAMP1基因克隆牛在ROSA26基因座上进行了精准插入,之后通过Southern Blot实验进一步验证了NRAMP1基因的定点整合,且在转基因克隆牛中为杂合单拷贝插入;使用Cas-OFFinder软件预测潜在脱靶位点,并对其中脱靶风险最高的8个潜在脱靶位点进行检测,结果显示在所有分析的潜在脱靶位点均未出现任何典型的插入缺失和位点突变。2.NRAMP1转基因牛抗结核功能检测。利用实时荧光定量PCR对ROSA26基因座邻近基因（SETD5、THUMPD3和LHFPL4）的表达水平进行检测,结果表明转基因牛基因组中外源插入的NRAMP1基因不影响相邻基因转录;通过Western blot对分离的转基因牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮肤和肌肉组织进行检测,发现NRAMP1基因只在富含巨噬细胞的脾脏中有明显的表达,表明插入基因的表达具有组织特异性;通过Western blot对分离的牛外周血巨噬细胞进行检测,发现攻菌后转基因牛巨噬细胞中NRAMP1基因的表达明显增强且表达量高于野生型牛;对牛外周血巨噬细胞攻菌后进行CFU分析,结果表明NRAMP1转基因克隆牛可以抑制M.bovis在巨噬细胞中的增殖,并且表现出比野生型荷斯坦奶牛更强的抗结核能力。综上所述,本研究证明了转基因克隆牛中NRAMP1基因在ROSA26基因座的精准插入,且转基因克隆牛巨噬细胞具有更强的抗结核感染能力,为抗结核病转基因牛的生物安全评价及良种扩繁提供了重要的研究基础。