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目的:帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)是继阿尔茨海默症之后的第二类重要的年龄相关的神经退行性疾病。花生四烯酸(arachidonicacid,AA)及其衍生物是参与炎症反应的重要内源性物质,其中环氧二十碳三酸(Epoxyeicosatrienoic acids,EETs)主要经细胞色素 P450 酶系(cytochrome P450,CYPs)中的 CYP2Js 和 CYP2Cs代谢生成。研究表明,在脑内CYP2Js表达量较为丰富,而CYP2Cs含量低。本文拟通过在体和离体实验,探究脑CYP2J在帕金森病(Parkinson disease,PD)动物模型中的可能保护作用及其机制。方法:U251细胞给予LPS(1μg/ml)作用24 h,或给予TLR4抑制剂CLI-095(1μM)和MyD88抑制剂ST2825(20 μM)预处理1h后,再给予LPS作用24h,qRT-PCR检测CYP2J2和转录因子CREB的表达,免疫荧光检测胞核内p-CREB的量,染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)检测 CREB 与 CYP2J2启动子结合情况。CYP2J2高表达质粒瞬时转染U251细胞24 h,qRT-PCR检测SOD1、NRF2、KEAP1、CAT、GPX1、MANF、PERK、IRE1α 和 ATF6 的表达。U251 细胞分别单给AUDA(1 μM)和14,15-EET(1 μM)作用24 h,或AUDA预处理1 h后,给予14,15-EET作用24h,qRT-PCR检测相关抗氧化应激基因表达。采用Wistar雄性大鼠,CYP2J3高表达质粒经慢病毒包装后转染动物黑质神经细胞,注射后3天、12天和21天处死动物,通过免疫组织荧光的方法观察转染效率。通过右侧黑质致密部定位注射LPS或6-OHDA建立大鼠PD模型(n= 9),动物注射后12天和21天,给予阿扑吗啡(0.5mg/kg),进行动物旋转行为学检测;于第21天处死动物,qRT-PCR检测CYP2J2、CREB以及相关抗氧化应激基因的表达;脑右侧黑质免疫组化TH+染色。在LPS诱导的PD动物模型中,大鼠随机分为对照组、单用LPS组(10μg)、LPS+CYP2J3高表达组、LPS +空载质粒组。在6-OHDA诱导的PD动物模型中,大鼠随机分为对照组、单用6-OHDA组(8μg)、6-OHDA+CYP2J3高表达组、6-OHDA+空载质粒组。CYP2J3高表达组动物黑质致密部注射CYP2J3高表达质粒(2 μL)3天后,再次注射LPS或6-OHDA;空载质粒组动物给予空载pHAGE质粒转染3天后注射LPS或6-OHDA;对照组动物于上述时间点在相同部位注射2μL无菌PBS或含0.2%维生素C的注射用生理盐水。结果:体外实验中,与对照组比较,LPS显著抑制CYP2J2和CREB的表达,其下降比例分别为67.43%和34.8%。与单用LPS组比较,TLR4抑制剂CLI-095预处理细胞1 h后合用LPS,CYP2J2和CREB mRNA水平分别上升2.5倍(p<0.001)和1.43倍(p<0.01)。与单用LPS组比较,MyD88抑制剂ST 2825预处理1 h后合用LPS,CYP2J2 和 CREB mRNA 水平,分别上升 2 倍(p<0.001)和 1.3 倍(p<0.01)。单用CLI-095和ST 2825组与对照组比较无统计学差异。转染CYP2J2表达质粒或外源性给予14,15-EET,抗氧化应激基因SOD1、CAT、GPX1、NRF2和KEAP1出现明显上调(p<0.001),而MANF、PERK、IRE1α、ATF6表达量则无明显改变(p>0.05)。免疫荧光分析,LPS显著降低了细胞核内p-CREB蛋白量(p<0.01)。ChIP分析,LPS抑制CREB与CYP2J2启动子结合(p<0.01)。在LPS诱导的大鼠PD模型中,12天和21天,LPS组动物旋转次数为115 rotations/0.5 h和233 rotations/0.5 h,而对照组未出现旋转。与LPS组相比,LPS+CYP2J3高表达组动物12天时旋转次数减少42.6%(p<0.01),21天旋转次数下降12.7%(p<0.05)。LPS+空载质粒组动物与LPS单用组无差异。免疫组化数据表明,LPS注射21天后右侧黑质多巴胺能神经元较健侧下降58%(p<0.01),LPS+CYP2J3高表达组右侧黑质多巴胺能神经元较健侧下降43%(p<0.01),而LPS+空载质粒组动物与LPS单用组无差异。与对照组相比,LPS抑制 CYP2J3 和抗氧化应激基因如 SOD1、CAT、GPX1、NRF2 和 KEAP1 表达(p<0.001);与LPS组相比,感染CYP2J3表达质粒后抗氧化应激基因如SOD1、CAT、GPX1、NRF2和KEAP1的表达量明显增加(p<0.001)。在6-OHDA诱导的大鼠PD模型中,12 天和 21 天,6-OHDA 组动物旋转次数为 118 rotations/0.5 h 和 241 rotations/0.5 h,而对照组未出现旋转。与6-OHDA组相比,6-OHDA+CYP2J3高表达组12天时旋转次数减少60.7%(p<0.01);21天时旋转次数下降21.4%(p<0.05),而6-OHDA +空载质粒组动物与6-OHDA单用组无差异。免疫组化数据表明,6-OHDA注射21天后右侧黑质多巴胺能神经元较健侧下降73.65%,6-OHDA+CYP2J3高表达组右侧黑质多巴胺能神经元较健侧下降57.8%,而6-OHDA+空载质粒组动物与6-OHDA单用组无差异。与对照组相比,6-OHDA组CYP2J3和抗氧化应激基因下调明显(p<0.001);与6-OHDA组相比,感染CYP2J3表达质粒后抗氧化应激基因如SOD1、CAT、GPX1、NRF2和KEAP1表达量明显增加(p<0.001)。结论:TLR4-MyD88通路参与LPS对CYP2J的调控作用。LPS通过抑制CREB与CYP2J2启动子位点的结合,进而在转录水平上抑制了 CYP2J2的表达。数据提示,转染CYP2J可上调抗氧化基因NRF2等的表达水平,改变神经细胞的氧化应激状态。外源性给予14,15-EET可以上调线粒体抗氧化基因表达,提示CYP2J可能通过代谢物EETs发挥保护神经细胞的作用。在神经炎症和氧化应激的PD动物模型中发现,黑质CYP2J具有保护多巴胺能神经元的作用,可延缓疾病进程。外源性给予CYP2J代谢物EETs有望在早期对抗神经炎症以及氧化刺激物所致多巴胺能神经元丢失。