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作为土壤和废水中常见的两种氮素形态，铵态氮(NH4+)和硝态氮(NO3-)分别占据自然界中最低价态氮和最高价态氮的位置。微生物可通过氮循环途径将这两种不同价态的氮素进行转化，但由于自然界中的微生物群落复杂多样，导致其参与的氮循环过程错综复杂，目前仍有新的氮循环途径被持续报道。此外，微生物转化氮素过程受到众多环境因素(如常见因素(温度、盐度和氮素浓度等)以及近几年才开始关注的金属离子和金属氧化物纳米颗粒等)的影响，不同微生物对不同环境因素的响应机制不同。课题组前期从贵州省长期淹水田中分离纯化得到一株好氧耐冷菌株PseudomonasputidaY-9，并通过研究发现菌株Y-9好氧氨氧化过程无中间产物羟胺(NH2OH)积累、好氧还原NO3-过程伴随有NH4+的生成，这与微生物好氧氨氧化过程一定经过NH2OH、微生物只在厌氧条件下进行异化硝态氮还原成铵(DNRA)的已有研究结果不一致，暗示菌株Y-9体内可能存在新的氮循环途径。
本研究在菌株P.putidaY-9的已有研究结果基础上，通过室内试验，分析菌株Y-9对NH4+、NH2OH和NO3-的转化特性，结合分子生物学手段(相关酶活分析、基因扩增、全基因组扫描等)以及15N同位素示踪技术探讨菌株Y-9在好氧条件下对NH4+和NO3-的具体转化途径，并进一步探索金属氧化物纳米颗粒在菌株Y-9生长必需金属元素(Mg2+)存在情况下对菌株氧化NH4+过程的影响机制；同时深入研究菌株体内的nirBD基因在菌株氮循环过程中的具体作用；最后探讨如何调节外界条件实现菌株Y-9对NO3-的大量去除和系统氮素的最小损失。主要结果如下：
(1)P.putidaY-9体内存在一条新的好氧氨氧化途径。菌株Y-9可在好氧条件下快速氧化NH4+(氧化率高达100%)，但该过程检测不到NH2OH、NO2-和NO3-。造成这种现象的原因可能有两种：一种是菌株体内NiR、NR以及HAO的活性显著高于AMO，导致生成的NH2OH和NO2-被迅速转化；另一种是菌株体内存在新的NH4+氧化途径。酶活试验发现菌株体内以NH2OH生成量定义的AMO未被检测到，但以NH4+降低量定义的AMO-a的活性显著大于HAO、NR及NiR，与已有好氧NH4+氧化途径不一致，初步证明菌株Y-9氧化NH4+过程并未经过NH2OH。通过分析NH4+、NH2OH单独以及共存条件下菌株Y-9对氮素的转化特性，发现菌株氧化NH2OH过程无气态氮生成，而氧化NH4+过程中可检测到NO和N2O，该现象进一步证明菌株Y-9氧化NH4+过程不经过NH2OH。硝化抑制剂烯丙基硫脲(ATU，一种被广泛应用于抑制AMO表达的抑制剂)对菌株氧化NH4+无抑制作用，且PCR扩增结果发现菌株Y-9体内不存在编码AMO的amoA基因，上述结果证明菌株Y-9体内不存在传统意义的AMO。综上所述，Y-9体内存在一条不经过羟胺形成NO和N2O的氨氧化新途径，而NH4+氧化成NO过程是否存在其他中间产物需进一步研究。
(2)金属氧化物纳米颗粒的存在会影响P.putidaY-9吸收Mg2+，进而影响菌株Y-9的氨氧化过程。高浓度的四种金属氧化物纳米颗粒(>1mg/L)均会抑制菌株Y-9的氨氧化过程，抑制强度顺序为NiONPs>CuONPs>ZnONPs>TiO2NPs，而低浓度的CuONPs(0.1、0.5 mg/L)和NiONPs(0.1 mg/L)则可促进菌株Y-9生长及其对NH4+的氧化效果，NH4+氧化率可达87%以上。金属氧化物纳米颗粒会在水中释放出金属离子，且不同浓度纳米颗粒释放出的金属离子浓度不同。进一步研究发现，系统中Mg2+的下降量与菌株Y-9生长及其对NH4+的氧化效果呈显著正相关性，但与TiO2NPs、ZnONPs和CuONPs在溶液中释放出的Ti4+、Zn2+和Cu2+含量呈负相关性。通过综合比较四种金属氧化物纳米颗粒及相应金属离子对菌株Y-9氧化NH4+过程的影响，发现金属氧化物纳米颗粒通过影响菌株Y-9对必需金属离子Mg2+的吸收从而影响菌株对NH4+的氧化效果，且不同金属氧化物纳米材料对菌株Y-9吸收Mg2+的影响机制不同，NiONPs通过其自身作用，TiO2NPs通过在水体溶解出的Ti4+，而CuONPs和ZnONPs则通过其自身作用及其在水体溶解出的Cu2+和Zn2+。
(3)P.putidaY-9可在好氧条件下同时进行同化NO3-还原、DNRA和反硝化作用。菌株Y-9可在好氧条件下高效去除水体NO3-(去除率为82.00%)并伴随有少量NH4+的积累，且系统TN去除率仅为21.08%，推测菌株可同时进行同化和异化NO3-还原作用。NH4+的存在会显著抑制菌株对NO3-的转化(NO3-去除率降至22.65%)，证明菌株Y-9具有较高的NO3-同化还原能力。但当系统NH4+充足时(92.75 mg/L)NO3-仍有所下降(下降量为11.68mg/L)，说明菌株Y-9可进行微弱的异化NO3-还原作用。菌株Y-9还原NO3-和NO2-过程中上清液检测到的NH4+由菌株胞内释放，且其体内编码亚硝态氮还原酶的nirBD基因会影响菌株生长和NH4+的生成，推测上清液中的NH4+可能由菌株同化NO3-再矿化过程或DNRA过程产生。15N同位素试验结果表明菌株Y-9体内存在由nirBD基因催化的DNRA过程，具体途径为NO3-→NO2-→NH4+，进一步表明系统TN下降是菌株进行反硝化作用的结果。综上所述，好氧条件下菌株Y-9体内同时存在3条硝态氮还原途径，其中nirBD可同时催化NO3-同化和DNRA过程中的NO2-还原为NH4+。
(4)P.putidaY-9体内的nirBD基因不仅可促进菌株的NO3-同化和DNRA进程，还会影响菌株的好氧氨氧化过程。菌株Y-9体内的亲水性稳定蛋白nirBD无跨膜结构，且具有与亚硝酸盐还原酶催化NO2-还原为NH4+紧密相关的亚硝酸和亚硫酸盐还原酶铁硫/硅血红素结合位点。培养2d后△nirBD菌株Y-9对NH4+的去除效率(90.70%)显著高于野生菌株Y-9(76.09%)，但△nirBD菌株Y-9培养系统TN下降量(15.73 mg/L)小于野生菌株Y-9培养系统TN下降量(17.74 mg/L)，结合菌株对NH4+的氧化途径证明敲除nirBD基因序列可促进菌株Y-9对NH4+的同化过程。nirBD基因通过促进菌株Y-9对NO3-的同化和DNRA过程去除系统中大量的NO3-和NO2-，敲除nirBD基因序列后导致由NO3-转化成的NO2-无法进一步还原为NH4+，造成系统NO2-大量积累，抑制菌株生长和反硝化过程。NO3-的存在对野生菌株和△nirBD菌株转化NH4+的影响均较小，培养结束后系统NH4+去除率仍高达90%以上。NO2-的存在会显著降低野生菌株Y-9对NH4+的去除效果(去除率仅为44.77%)，但不会抑制△nirBD菌株Y-9对NH4+的利用效率(培养结束后系统NH4+去除率仍高达97.49%)，这可能是由于敲除nirBD基因序列对菌株同化NH4+的促进作用抵消了NO2-对菌株的毒性作用。
(5)调节外界条件可实现菌株Y-9对硝态氮的大量去除和系统氮素的最小损失。葡萄糖可刺激菌株Y-9体内nirBD基因的表达，促进菌株进行DNRA和同化NO3-作用，大量去除系统中NO3-(去除率为89.79%)，且系统氮素的损失量较少(22.77 mg/L)。好氧条件下不同C/N培养基中菌株Y-9体内nirBD基因均可有效表达，其中C/N为9时nirBD基因表达量最大，菌株可高效进行DNRA和同化NO3-作用，从而大量去除NO3-(81.78%)，且菌株体内的反硝化过程(TN下降量为14.06mg/L)显著弱于C/N为12和15条件下菌株的反硝化过程(TN下降量分别为35.41和22.77mg/L)。中性和弱碱性条件(pH 7-9)对菌株Y-9同化NO3-、DNRA和反硝化过程均有促进作用，其中以初始pH为7的培养液培养4d后菌株Y-9体内nirBD基因表达量最大，菌株对NO3-的去除率与初始pH为8和9的培养液中菌株对NO3-的去除率一致，均约为80%；但系统TN的下降量(14.06 mg/L)显著低于初始pH为8和9培养液中系统TN的下降量(30.64和35.01mg/L)。随转速的增大，菌株Y-9体内nirBD基因的表达量逐渐增大，菌株对NO3-的还原能力逐渐增强，但系统TN的下降量则呈现先上升后下降的趋势(50rpm条件下TN下降量最大，为34.58mg/L)。综合分析上述研究结果可知，以葡萄糖为碳源，控制C/N为9，pH为7，转速为150rpm时菌株Y-9同化NO3-和DNRA进程较强，反硝化进程较弱，可大量去除NO3-且系统氮素损失量最小。
综上所述，P.putidaY-9体内存在两条新的氮素转化途径，可在好氧条件下大量去除NH4+和NO3-，且几乎无有害中间产物NO2-的积累，说明菌株Y-9在氮素污染废水治理中具有广泛的应用前景。此外，外界条件对菌株体内NO3-同化、DNRA和反硝化过程影响的研究结果可为土壤NO3-去除和氮素保持方面的技术研究提供理论支撑。
本研究在菌株P.putidaY-9的已有研究结果基础上，通过室内试验，分析菌株Y-9对NH4+、NH2OH和NO3-的转化特性，结合分子生物学手段(相关酶活分析、基因扩增、全基因组扫描等)以及15N同位素示踪技术探讨菌株Y-9在好氧条件下对NH4+和NO3-的具体转化途径，并进一步探索金属氧化物纳米颗粒在菌株Y-9生长必需金属元素(Mg2+)存在情况下对菌株氧化NH4+过程的影响机制；同时深入研究菌株体内的nirBD基因在菌株氮循环过程中的具体作用；最后探讨如何调节外界条件实现菌株Y-9对NO3-的大量去除和系统氮素的最小损失。主要结果如下：
(1)P.putidaY-9体内存在一条新的好氧氨氧化途径。菌株Y-9可在好氧条件下快速氧化NH4+(氧化率高达100%)，但该过程检测不到NH2OH、NO2-和NO3-。造成这种现象的原因可能有两种：一种是菌株体内NiR、NR以及HAO的活性显著高于AMO，导致生成的NH2OH和NO2-被迅速转化；另一种是菌株体内存在新的NH4+氧化途径。酶活试验发现菌株体内以NH2OH生成量定义的AMO未被检测到，但以NH4+降低量定义的AMO-a的活性显著大于HAO、NR及NiR，与已有好氧NH4+氧化途径不一致，初步证明菌株Y-9氧化NH4+过程并未经过NH2OH。通过分析NH4+、NH2OH单独以及共存条件下菌株Y-9对氮素的转化特性，发现菌株氧化NH2OH过程无气态氮生成，而氧化NH4+过程中可检测到NO和N2O，该现象进一步证明菌株Y-9氧化NH4+过程不经过NH2OH。硝化抑制剂烯丙基硫脲(ATU，一种被广泛应用于抑制AMO表达的抑制剂)对菌株氧化NH4+无抑制作用，且PCR扩增结果发现菌株Y-9体内不存在编码AMO的amoA基因，上述结果证明菌株Y-9体内不存在传统意义的AMO。综上所述，Y-9体内存在一条不经过羟胺形成NO和N2O的氨氧化新途径，而NH4+氧化成NO过程是否存在其他中间产物需进一步研究。
(2)金属氧化物纳米颗粒的存在会影响P.putidaY-9吸收Mg2+，进而影响菌株Y-9的氨氧化过程。高浓度的四种金属氧化物纳米颗粒(>1mg/L)均会抑制菌株Y-9的氨氧化过程，抑制强度顺序为NiONPs>CuONPs>ZnONPs>TiO2NPs，而低浓度的CuONPs(0.1、0.5 mg/L)和NiONPs(0.1 mg/L)则可促进菌株Y-9生长及其对NH4+的氧化效果，NH4+氧化率可达87%以上。金属氧化物纳米颗粒会在水中释放出金属离子，且不同浓度纳米颗粒释放出的金属离子浓度不同。进一步研究发现，系统中Mg2+的下降量与菌株Y-9生长及其对NH4+的氧化效果呈显著正相关性，但与TiO2NPs、ZnONPs和CuONPs在溶液中释放出的Ti4+、Zn2+和Cu2+含量呈负相关性。通过综合比较四种金属氧化物纳米颗粒及相应金属离子对菌株Y-9氧化NH4+过程的影响，发现金属氧化物纳米颗粒通过影响菌株Y-9对必需金属离子Mg2+的吸收从而影响菌株对NH4+的氧化效果，且不同金属氧化物纳米材料对菌株Y-9吸收Mg2+的影响机制不同，NiONPs通过其自身作用，TiO2NPs通过在水体溶解出的Ti4+，而CuONPs和ZnONPs则通过其自身作用及其在水体溶解出的Cu2+和Zn2+。
(3)P.putidaY-9可在好氧条件下同时进行同化NO3-还原、DNRA和反硝化作用。菌株Y-9可在好氧条件下高效去除水体NO3-(去除率为82.00%)并伴随有少量NH4+的积累，且系统TN去除率仅为21.08%，推测菌株可同时进行同化和异化NO3-还原作用。NH4+的存在会显著抑制菌株对NO3-的转化(NO3-去除率降至22.65%)，证明菌株Y-9具有较高的NO3-同化还原能力。但当系统NH4+充足时(92.75 mg/L)NO3-仍有所下降(下降量为11.68mg/L)，说明菌株Y-9可进行微弱的异化NO3-还原作用。菌株Y-9还原NO3-和NO2-过程中上清液检测到的NH4+由菌株胞内释放，且其体内编码亚硝态氮还原酶的nirBD基因会影响菌株生长和NH4+的生成，推测上清液中的NH4+可能由菌株同化NO3-再矿化过程或DNRA过程产生。15N同位素试验结果表明菌株Y-9体内存在由nirBD基因催化的DNRA过程，具体途径为NO3-→NO2-→NH4+，进一步表明系统TN下降是菌株进行反硝化作用的结果。综上所述，好氧条件下菌株Y-9体内同时存在3条硝态氮还原途径，其中nirBD可同时催化NO3-同化和DNRA过程中的NO2-还原为NH4+。
(4)P.putidaY-9体内的nirBD基因不仅可促进菌株的NO3-同化和DNRA进程，还会影响菌株的好氧氨氧化过程。菌株Y-9体内的亲水性稳定蛋白nirBD无跨膜结构，且具有与亚硝酸盐还原酶催化NO2-还原为NH4+紧密相关的亚硝酸和亚硫酸盐还原酶铁硫/硅血红素结合位点。培养2d后△nirBD菌株Y-9对NH4+的去除效率(90.70%)显著高于野生菌株Y-9(76.09%)，但△nirBD菌株Y-9培养系统TN下降量(15.73 mg/L)小于野生菌株Y-9培养系统TN下降量(17.74 mg/L)，结合菌株对NH4+的氧化途径证明敲除nirBD基因序列可促进菌株Y-9对NH4+的同化过程。nirBD基因通过促进菌株Y-9对NO3-的同化和DNRA过程去除系统中大量的NO3-和NO2-，敲除nirBD基因序列后导致由NO3-转化成的NO2-无法进一步还原为NH4+，造成系统NO2-大量积累，抑制菌株生长和反硝化过程。NO3-的存在对野生菌株和△nirBD菌株转化NH4+的影响均较小，培养结束后系统NH4+去除率仍高达90%以上。NO2-的存在会显著降低野生菌株Y-9对NH4+的去除效果(去除率仅为44.77%)，但不会抑制△nirBD菌株Y-9对NH4+的利用效率(培养结束后系统NH4+去除率仍高达97.49%)，这可能是由于敲除nirBD基因序列对菌株同化NH4+的促进作用抵消了NO2-对菌株的毒性作用。
(5)调节外界条件可实现菌株Y-9对硝态氮的大量去除和系统氮素的最小损失。葡萄糖可刺激菌株Y-9体内nirBD基因的表达，促进菌株进行DNRA和同化NO3-作用，大量去除系统中NO3-(去除率为89.79%)，且系统氮素的损失量较少(22.77 mg/L)。好氧条件下不同C/N培养基中菌株Y-9体内nirBD基因均可有效表达，其中C/N为9时nirBD基因表达量最大，菌株可高效进行DNRA和同化NO3-作用，从而大量去除NO3-(81.78%)，且菌株体内的反硝化过程(TN下降量为14.06mg/L)显著弱于C/N为12和15条件下菌株的反硝化过程(TN下降量分别为35.41和22.77mg/L)。中性和弱碱性条件(pH 7-9)对菌株Y-9同化NO3-、DNRA和反硝化过程均有促进作用，其中以初始pH为7的培养液培养4d后菌株Y-9体内nirBD基因表达量最大，菌株对NO3-的去除率与初始pH为8和9的培养液中菌株对NO3-的去除率一致，均约为80%；但系统TN的下降量(14.06 mg/L)显著低于初始pH为8和9培养液中系统TN的下降量(30.64和35.01mg/L)。随转速的增大，菌株Y-9体内nirBD基因的表达量逐渐增大，菌株对NO3-的还原能力逐渐增强，但系统TN的下降量则呈现先上升后下降的趋势(50rpm条件下TN下降量最大，为34.58mg/L)。综合分析上述研究结果可知，以葡萄糖为碳源，控制C/N为9，pH为7，转速为150rpm时菌株Y-9同化NO3-和DNRA进程较强，反硝化进程较弱，可大量去除NO3-且系统氮素损失量最小。
综上所述，P.putidaY-9体内存在两条新的氮素转化途径，可在好氧条件下大量去除NH4+和NO3-，且几乎无有害中间产物NO2-的积累，说明菌株Y-9在氮素污染废水治理中具有广泛的应用前景。此外，外界条件对菌株体内NO3-同化、DNRA和反硝化过程影响的研究结果可为土壤NO3-去除和氮素保持方面的技术研究提供理论支撑。