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目的:血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）异常增殖是多种血管重塑性疾病的病理过程。tRNA来源小RNA（tRNA-derived small RNA,tsRNA）是一类来源于 tRNA 的非编码 RNA（non-coding RNA,ncRNA）,能够调控细胞增殖、凋亡及自噬等多种重要的生物学过程。然而,tsRNA对VSMC增殖的调控尚不完全清楚。本研究中,我们使用测序方法分析增殖型和静止型人主动脉平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cell,HASMC）的tsRNA表达谱。实时定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）验证差异表达的tsRNA,并检测其在细胞核和细胞质内的分布比例。基于tsRNA的miRNA样功能,从胞核（激活/沉默DNA转录）和胞浆（抑制mRNA翻译）两个角度出发,预测tsRNA靶基因,构建相互作用网络,使用基因本体论（Gene Ontology,GO）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析靶基因功能。最后,选择AS-tDR-000067和AS-tDR-000076两个tsRNA作为研究对象,进行功能论证和靶点鉴定。方法:1.高通量RNA测序分析tsRNA表达谱采用高通量RNA测序技术对三组增殖型和静止型HASMC中的tsRNA表达谱进行分析,增殖型HASMC使用胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）和平滑肌细胞生长因子（smooth muscle cell growth supplement,SMCGS）诱导,静止型HASMC由FBS和SMCGS饥饿诱导,差异表达tsRNA的选择标准是差异倍数≥2或≤-2且P<0.05。2.AS-tDR-001370、AS-tDR-000067、AS-tDR-009512和AS-tDR-000076差异表达的验证通过 qRT-PCR 检测 AS-tDR-001370、AS-tDR-000067、AS-tDR-009512和AS-tDR-000076在增殖型和静止型HASMC中的差异表达,并使用2-△△Ct方法计算差异表达倍数。3.AS-tDR-001370、AS-tDR-000067、AS-tDR-009512和AS-tDR-000076在细胞核和细胞质分布的检测采用细胞核/细胞质分离试剂盒将增殖型HASMC胞核和胞质组分分离,各自提取小RNA再反转录,通过qRT-PCR检测AS-tDR-001370、AS-tDR-000067、AS-tDR-009512和AS-tDR-000076在胞核和胞质中的分布比例。4.AS-tDR-001370、AS-tDR-000067、AS-tDR-009512和AS-tDR-000076与启动子（promoter）互作分析从胞核miRNA靶向基因启动子调控转录的角度出发,我们使用RNAhybrid 和 MiRanda 预测 4 种 tsRNA（AS-tDR-001370、AS-tDR-000067、AS-tDR-009512和AS-tDR-000076）互作的靶基因启动子。随后,将4组预测的胞核靶基因与增殖型HASMC（GSE77279）中的差异表达mRNA（differentially expressed mRNA,DEmRNA）（fold change≥2 or≤-2,P<0.05）取交集,得到4组增殖相关的胞核靶基因,这里我们用promoter表示,并通过Cytoscapev3.7.1绘制4种tsRNA-promoter相互作用网络。最后,采用GO和KEGG通路分析,对4种tsRNA的胞核靶基因进行功能分析。5.AS-tDR-001370、AS-tDR-000067、AS-tDR-009512和AS-tDR-000076与mRNA互作分析从胞质miRNA靶向mRNA调控翻译的角度出发,我们使用Taregetscan 和 MiRanda 分别预测 4 种 tsRNA（AS-tDR-001370、AS-tDR-000067、AS-tDR-009512 和 AS-tDR-000076）的胞质靶基因,再与增殖型 HASMC（GSE77279）中的 DEmRNA（fold change≤-1.5,P<0.05）相交,得到与4种tsRNA互作的增殖相关mRNA。已知环状RNA（circular RNA,circRNA）可与miRNA产生互作,但是否与tsRNA产生互作尚不完全清楚。我们使用Targetscan数据库分别预测4种tsRNA可能结合的circRNA,再与增殖型HASMC（GSE77278）中的差异表达 circRNA（differentially expressed circRNA,DEcircRNA）（fold change ≥ 2 or ≤-2,P<0.05）相交,得到与4种tsRNA互作的增殖相关circRNA。最后,我们使用Cytoscapev3.7.1绘制4组tsRNA-mRNA和circRNA-tsRNA相互作用网络,并采用GO和KEGG通路分析,对4种tsRNA的胞质靶基因进行功能分析。6.AS-tDR-000067 和 AS-tDR-000076 对 HASMC 增殖的调控作用根据AS-tDR-000067和AS-tDR-000076序列,设计并合成单链反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotide,ASO）,转染至增殖型HASMC,qRT-PCR验证敲减效率,EdU荧光染色检测HASMC增殖活力,Western blot检测靶基因表达水平。7.hsa—circ—0001402可能通过AS-tDR-000067-p53/mitofusin 2（MFN2）轴调控VSMC增殖根据circRNA-tsRNA相互作用网络,选取与AS-tDR-000067互作的hsa＿circ＿0001402做进一步分析。我们前期工作已经证明了hsa＿circ＿0001402 能够抑制 HASMC 增殖,因此推测 hsa＿circ＿0001402 可能通过AS-tDR-000067-p53/MFN2轴调控VSMC增殖。将hsa＿circ＿0001402过表达质粒转染至增殖型HASMC,Western blot检测p53和MFN2的蛋白表达水平。8.AS-tDR-000067相关报告基因载体的构建构建hsa＿circ＿0001402-WT和MFN2-WT的报告基因质粒。根据hsa＿circ＿0001402和MFN2在AS-tDR-000067的结合位点,化学合成野生型序列,并在其5’端和3’端分别引入XhoⅠ酶和NotⅠ酶的粘性末端,插入psiCHECKTM-2 Vector,转化后挑取单个菌落,进行菌落PCR、单酶切鉴定和测序分析。结果:1.高通量RNA测序结果显示,与静止型HASMC相比,增殖型HASMC中887种tsRNA表达水平升高,951种tsRNA表达水平下降。2.通过 qRT-PCR,验证 4 种 tsRNA（AS-tDR-001370、AS-tDR-000067、AS-tDR-009512和AS-tDR-000076）在增殖型和静止型HASMC中的差异表达。结果显示,与静止型HASMC相比,增殖型HASMC中4种tsRNA的表达水平升高,这与测序结果相吻合。3.qRT-PCR结果显示,4种tsRNA在增殖型HASMC的胞浆和胞核内均有分布,且胞核tsRNA的含量显著高于胞浆。4.RNAhybrid和 MiRanda 的预测和相交结果表明,胞核AS-tDR-001370可能靶向 243 种 promoter,胞核 AS-tDR-000067可能靶向854 种 promoter,胞核 AS-tDR-009512 可能靶向 202 种 promoter,胞核AS-tDR-000076可能靶向120种promoter。GO和KEGG通路分析显示,4种tsRNA的胞核靶基因涉及多种增殖相关通路。5.TargetScan和MiRanda 的预测和相交结果表明,胞质AS-tDR-001370可能靶向 46 种 mRNA,胞质 AS-tDR-000067可能靶向 69种mRNA,胞质AS-tDR-009512可能靶向 184种mRNA,胞质AS-tDR-000076可能靶向306种mRNA。GO和KEGG通路分析显示,4种tsRNA的靶点mRNA涉及多种增殖相关通路。RNAhybrid的预测和相交结果显示,21种circRNA可能靶向AS-tDR-001370,7 1 种 circRNA 可能靶向 AS-tDR-000067,37 种 circRNA可能靶向 AS-tDR-009512,53 种 circRNA 可能靶向 AS-tDR-000076。6.使用ASO分别敲减增殖型HASMC中的AS-tDR-000067和AS-tDR-000076,qRT-PCR结果显示,敲减效率超过60%。EdU荧光染色结果显示,敲减AS-tDR-000067和AS-tDR-000076会显著抑制HASMC的增殖活力。Western blot分析表明,敲减AS-tDR-000067能够促进胞核靶基因p53和胞质靶基因MFN2的表达,敲减AS-tDR-000076能够抑制胞核靶基因 IGF2BP2（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 2）的表达,并促进胞质靶基因p53的表达。7.将hsa＿circ＿0001402过表达质粒转染至增殖型HASMC,Western blot分析表明,p53和MFN2的表达水平显著升高。8.经菌落 PCR、单酶切鉴定和测序分析共同证实hsa＿circ＿0001402-WT和MFN2-WT报告基因质粒构建完成,为后续的机制实验奠定基础。结论:1.在HASMC增殖过程中,许多tsRNA的表达水平发生变化。生物信息学分析表明,tsRNA可能通过两种方式发挥调控作用,即胞核tsRNA靶向基因启动子调控转录,胞浆tsRNA靶向mRNA调控翻译,并首次提出circRNA可能靶向tsRNA调控mRNA翻译的假说。2.AS-tDR-000067 和 AS-tDR-000076 可以促进 VSMC 增殖,并有希望成为VSMC增殖相关血管重塑性疾病的治疗靶点。