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背景银屑病是常见的慢性炎症性皮肤病,患者临床表现主要为境界清楚的红斑、斑块,上覆鳞屑。银屑病典型的组织病理表现为:表皮过度增生,真皮内淋巴细胞浸润,并可见真皮乳头内毛细血管扩张。多种因素如遗传背景、环境、药物、精神压力等均能诱发银屑病发病。以T细胞为主的多种免疫细胞在银屑病免疫紊乱中起重要作用,其中Th17细胞异常活化,产生白介素17A（IL-17A）等效应细胞因子已被证明是介导银屑病发病的核心环节。生物制剂靶向IL-23/IL-17通路治疗银屑病取得了良好效果,临床表现改善,病理及免疫组化的表现也明显改善。调节性T细胞是一群具有负向免疫调控作用的T细胞亚群,在维持机体免疫稳态、自我耐受,以及在预防自身免疫病发病中不可或缺。当体内Treg细胞的免疫抑制功能受损或细胞数量不足时,效应T细胞则会异常过度活化,导致免疫稳态失衡,介导多种自身免疫病发生。我们课题组和其他学者的前期研究已经证明,银屑病患者存在Treg细胞功能低下的现象,但其发生机制尚不清楚。以IL-17A为代表的银屑病相关炎症因子是否直接作用于Treg细胞从而干扰其免疫抑制功能,需要进一步深入研究。目的探讨IL-17A对Treg细胞免疫抑制功能的影响,明确下游机制。揭示IL-17A干扰Treg细胞免疫抑制功能在银屑病发病中的作用。评价IL-17A单抗治疗银屑病对Treg细胞功能的恢复作用及其意义。方法1.IL-17A对调节性T细胞免疫抑制功能的影响:收集银屑病患者及正常人PBMC,流式分选Treg及Teff进行共培养,根据不同实验目的加入不同浓度IL-17A,培养5天后流式分析检测CFSE信号,统计分析Teff增殖率及Treg抑制率。分选Treg培养,加入IL-17A,检测IL-17A对Treg增殖和凋亡的影响。2.IL-17A对调节性T细胞转录因子和效应分子表达的影响:收集正常人来源PBMC,磁珠或流式分选出Treg细胞,给予IL-17A刺激,培养48小时,收集细胞提取RNA进行测序或RT-PCR实验检测基因表达水平;或用流式细胞术检测IL-17A刺激Treg细胞后主要相关炎症因子、转录因子和IL-10、TGF-β、CTLA-4等抑制性因子的产生释放。3.IL-17A对调节性T细胞信号通路活化的检测:收集正常人来源的PBMC,磁珠或流式分选出Treg细胞,给与IL-17A刺激,培养30分钟。收集Treg细胞,利用流式细胞术和免疫荧光等方法检测IL-17A刺激Treg后胞内NF-κB、MAPK、ERK通路变化。并在该体系中加入NF-κB抑制剂,明确IL-17A活化NF-κB通路对于Treg分泌细胞因子的影响。4.接受IL-17A单抗治疗的银屑病患者调节性T细胞功能变化分析:募集3例寻常型银屑病患者,记录其治疗前后临床表现并计算PASI评分。收集司库奇尤单抗治疗前后银屑病患者PBMC,流式分选出Treg及Teff进行共培养,统计分析Teff细胞增殖率及Treg抑制率。流式检测患者PBMC中Treg的比例以及Treg抑制因子TGF-β的产生释放。结果1.银屑病患者调节性T细胞的免疫抑制能力受损:流式检测结果显示,与正常人来源的Treg相比,银屑病患者来源的Treg对自身Teff增殖的免疫抑制能力明显降低。2.银屑病患者调节性T细胞异常高表达基因富集于IL-17通路:分析本课题组前期得到的银屑病患者和正常人Treg基因表达谱芯片,发现银屑病患者Treg异常高表达的差异基因主要富集于IL-17通路。3.IL-17A干扰调节性T细胞对效应T细胞的抑制功能:流式分析实验显示,IL-17A对Treg增殖和凋亡无显著影响;IL-17A对Teff的增殖也无明显影响。IL-17A直接作用于Treg干扰其对Teff增殖的抑制能力。4.IL-17A通过抑制调节性T细胞释放TGF-β影响其对效应T细胞的抑制能力:RNA测序结果显示,IL-17A处理Treg细胞后TGF-β表达下调。RT-PCR结果表明,IL-17A抑制Treg细胞表达TGF-β,促进IFN-γ表达。流式结果表明,IL-17A抑制Treg细胞分泌TGF-β,促进IFN-γ分泌。5.IL-17A通过激活调节性T细胞NF-κB通路促进IFN-γ分泌发挥其促炎作用:免疫荧光结果表明,IL-17A可以促进Treg细胞NF-κB通路活化,pp65荧光信号增强并入核增加,MFI值升高,而对于MAPK、ERK无影响。流式结果表明,IL-17A能够促进Treg细胞NF-κB活化,pp65阳性Treg细胞比例增加。流式细胞及RT-PCR结果表明IL-17A能够促进Treg分泌IFN-γ;而加入NF-κB抑制剂后,IL-17A不能促进Treg分泌IFN-γ。6.IL-17A单抗有效治疗银屑病后患者调节性T细胞抑制能力得到恢复:患者接受抗IL-17A单抗治疗后,银屑病皮损明显好转,PASI评分下降。接受抗IL-17A单抗治疗后,患者Treg对于Teff的抑制能力恢复,恢复到相当于正常人来源Treg的水平,同时Treg细胞分泌TGF-β水平恢复。结论银屑病患者Treg细胞免疫抑制功能的不足与体内高水平的IL-17A密切相关。IL-17A作用于Treg细胞从两个方面干扰其功能:一方面,IL-17A直接抑制其主要效应因子TGF-β的产生释放,使其无法发挥对效应T细胞的抑制作用;另一方面,IL-17A还可激活Treg细胞的NF-κB信号通路,促进p65磷酸化并易位至细胞核内,介导IFN-γ等炎性细胞因子的分泌,发挥其促炎作用。我们的研究证实,Treg细胞在IL-17A的作用下不仅失去了抑制效应T细胞的免疫抑制能力,还起到促进炎症的作用,是银屑病免疫学发病机制中的重要新发现。利用IL-17A单抗治疗银屑病,能够一定程度地逆转IL-17A对Treg细胞的干扰作用,恢复其免疫抑制功能,是对IL-17A单抗治疗策略疗效机制的补充,也为银屑病的长期管理提供了新的思路。