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研究背景和目的:Bruton’s酪氨酸激酶（Bruton’tyrosine kinase,BTK）参与B细胞正常发育、且参与维持恶性细胞异常表型。BTK其实不仅表达于B细胞,同时也表达于其他多种非T系造血细胞,靶向BTK具有较为广泛的临床应用价值。伊布替尼是第一代BTK抑制剂,已在多种B系淋巴肿瘤的临床治疗中凸显优越疗效。多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一种较常见的造血系肿瘤,至今难以治愈,进一步探索其耐药机制、寻找新的治疗靶点及更有效的联合治疗方案有迫切的临床需求。伊布替尼在MM中具有一定的应用前景,临床前及临床研究也证实伊布替尼在MM中的有效性,但也有研究提示疗效的有限性。进一步探索伊布替尼在MM中的作用及可能存在的耐药机制,有助于伊布替尼在MM中的拓展应用。自噬与MM关系密切,往往作为MM细胞的一种生存机制存在,但其也可以启动死亡通路,诱导自噬性细胞死亡。自噬受到化疗药物压力、DNA损伤等细胞内外多种因素的影响,是一个受多分子共同严密调控的多步骤过程。伊布替尼的抗MM效应是否与自噬相关尚未见报道,关于在MM细胞中伊布替尼如何调控自噬以及自噬与伊布替尼治疗有效性之间的关系需进一步研究。本课题围绕伊布替尼对于MM细胞自噬的调控与可能涉及的机制以及自噬在伊布替尼抗MM效应中的作用进行研究,旨在寻找新的联合治疗方案,以期提高伊布替尼治疗MM的有效性。方法:第一部分:1.用MTT检测不同浓度伊布替尼对MM细胞系RPMI8226及H929细胞活力的影响;2.用流式技术及western blot方法评价伊布替尼对MM细胞周期分布及凋亡的作用;3.用western blot方法检测伊布替尼单药对MM细胞DNA损伤蛋白的影响;4.用western blot、PCR及透射电镜观察伊布替尼对MM细胞自噬反应的影响;5.探索伊布替尼诱导自噬的可能机制。首先用western blot观察ATM抑制剂KU-55933与伊布替尼合用后LC3B表达量变化,探索DNA损伤反应与自噬活化的关系;Western blot及PCR检测伊布替尼对MM细胞组蛋白H4赖氨酸16乙酰化（H4K16ac）及其调控子SIRT1、h MOF表达的影响,染色质免疫共沉淀联合q PCR观察LC3B启动子区H4K16ac募集量变化;第二部分:1.Western blot技术观察自噬抑制剂3-MA、HCQ及BAF与伊布替尼分别单药或合用后对MM细胞自噬蛋白LC3B表达的影响,透射电镜观察细胞内自噬泡变化;2.通过MTT观察伊布替尼单用或联合自噬抑制剂3-MA、HCQ及BAF后对MM细胞活力的影响;3.应用流式细胞术观察伊布替尼单用或联合自噬抑制剂3-MA、HCQ及BAF后对MM细胞S期比例的影响;4.应用软琼脂克隆形成实验观察伊布替尼单用或联合自噬抑制剂3-MA、HCQ及BAF对MM细胞克隆形成能力的影响;5.应用western blot分析伊布替尼单用或联合自噬抑制剂3-MA、HCQ及BAF后对MM细胞DNA损伤的影响;6.应用流式细胞术及western blot观察伊布替尼与3-MA、HCQ及BAF单独或联合处理后对MM细胞凋亡的作用;7.建立H929细胞裸鼠皮下成瘤模型,检测HCQ与伊布替尼联用对裸鼠皮下移植瘤的抑制作用,应用HE染色、TUNEL染色及免疫组化判断肿瘤细胞增殖与凋亡;8.应用MTT检测伊布替尼单药或联合小剂量HCQ及3-MA处理后对原代MM细胞活力的影响。结果:第一部分:伊布替尼活化MM细胞自噬反应及其机制探索1.伊布替尼抑制MM细胞的增殖、诱导DNA损伤及凋亡,通过调控p21及cyclin D1,阻滞细胞周期于G0/G1期;2.伊布替尼活化MM细胞自噬反应,ATG5、ATG7及LC3B在蛋白及m RNA水平上表达上调,p62蛋白表达量减少;相应地,透射电镜可见伊布替尼处理后细胞内自噬体增多;3.KU-55933能减少伊布替尼诱导的LC3B增加,下调伊布替尼诱导的自噬活化;4.伊布替尼在m RNA水平及蛋白水平下调SIRT1,使细胞内组蛋白H4K16ac蛋白总体表达增加,并上调LC3B启动子区的H4K16ac募集,进而促进LC3B基因转录。第二部分:靶向抑制自噬增强伊布替尼的抗MM活性1.3-MA与伊布替尼合用后,下调伊布替尼诱导的MM细胞LC3B-Ⅱ及自噬体形成;HCQ和BAF与伊布替尼合用后,MM细胞LC3B-Ⅱ蛋白表达及自噬体含量均增加;2.伊布替尼联用自噬抑制剂3MA、HCQ及BAF后,进一步抑制MM细胞活力;3.伊布替尼联合自噬抑制剂3MA、HCQ及BAF后,使MM细胞S期比例进一步减少;4.伊布替尼与自噬抑制剂3MA、HCQ及BAF合用后,能进一步抑制MM细胞软琼脂克隆形成;5.自噬抑制剂3MA、HCQ及BAF能够增强伊布替尼诱导的MM细胞DNA损伤;6.自噬抑制剂3MA、HCQ及BAF能够增强伊布替尼诱导的MM细胞凋亡;7.裸鼠体内试验证实,相对于空白对照组,HCQ与伊布替尼合用后能明显抑制肿瘤生长,组化染色提示合用组Ki67阳性细胞减少、cleaved caspase-3阳性细胞增加,TUNEL染色提示两药合用组细胞凋亡率明显增加;8.自噬抑制剂HCQ及3-MA增加伊布替尼对原代MM细胞活力的抑制。结论:1.伊布替尼抑制MM细胞增殖、诱导MM细胞DNA损伤,使细胞周期停滞于G0/G1期,并诱导MM细胞凋亡;2.伊布替尼活化MM细胞自噬反应,伊布替尼活化自噬的机制受到组蛋白H4K16ac表观遗传调控;3.伊布替尼所诱导的自噬为细胞保护性自噬,靶向抑制自噬能够增强伊布替尼的体内外抗MM活性。