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研究背景孤独症谱系障碍（Autism spectrum disorder,ASDs）是一组神经发育障碍性症候群。该病起病于婴幼儿时期,但持续终身,需要长期康复训练治疗和终身的社会支持,继而给患者家庭及社会带来巨大的心理和经济负担。社交行为障碍是孤独症病人的核心症状之一。由于不同患者社交障碍具有高度异质性,使得社交障碍的治疗和研究均异常困难,其原因之一在于社交行为本身的神经工作机制尚未完全清楚。临床研究显示,前扣带回皮层（Anterior cingulate cortex,ACC）在社交相关行为中激活,而存在社交障碍的精神疾病患者ACC出现代谢和功能性连接异常。更重要的是,ACC与调控社交行为不同阶段的多个神经网络存在突触联系,例如观察性学习、社交情感以及价值处理网络等,强烈提示ACC在社交行为中的重要调控作用。然而ACC是否参与以及如何参与ASDs小鼠的社交障碍目前尚未报道。SHANK家族（SH3 and multiple ankyrin repeat domains,Shank1-3）编码兴奋性突触后致密体支架蛋白,连接PSD-95（Postsynaptic Density protein-95）、Homer等分子,与谷氨酸离子型、代谢型受体和细胞骨架蛋白等相互作用,能够促进兴奋性突触的形成、树突棘的发育以及维持突触功能的稳定。临床研究发现Shank3单基因突变可导致ASDs的发生,Shank3敲除小鼠也出现了社交行为障碍、刻板行为等典型的ASDs样表现。因此Shank3敲除小鼠是目前研究ASDs兴奋性突触改变机制较好的模式动物之一。本研究利用Shank3敲除小鼠作为研究模型,从ACC的兴奋性突触切入,发现Shank3敲除小鼠ACC的兴奋性突触存在结构和功能异常,而兴奋性突触的异常进而引起了ACC锥体神经元活动降低。通过光遗传学特异性激活、抑制ACC锥体神经元活动,能够改善Shank3敲除小鼠社交行为障碍或诱发野生型小鼠出现ASDs样的社交行为异常。通过在体ACC局部特异性敲除或再表达Shank3,能够双向调节ACC突触功能及社交行为。全身或ACC局部给予AMPA（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid）受体的正向变构调节剂CX546能够增强ACC兴奋性突触功能,改善Shank3敲除小鼠的社交行为障碍。本研究揭示了ACC参与孤独症社交行为障碍的新机制,阐明了Shank3缺失引起的ACC兴奋性突触功能损伤与社交行为障碍的内在联系,为理解ASDs的社交障碍机制、开发潜在的药物或干预靶点提供了新思路。研究方法1)兴奋性突触形态:利用腺相关病毒（AAV）及森林脑炎病毒（SFV）稀疏标记ACC锥体神经元,并通过Imaris进行3D图像重塑分析神经元形态和树突分支及树突棘形态。利用透射电镜拍摄ACC兴奋性突触,分析突触后致密带长度及厚度。2)兴奋性突触功能:利用膜片钳技术在离体脑片上记录ACC锥体神经元,分析微小型兴奋性突触后电流（m EPSCs）、双脉冲刺激（PPR）、不同谷氨酸受体介导的兴奋性电流、长时程增强（LTP）等突触功能指标。利用免疫印迹（Western Blot）方法检测不同谷氨酸受体亚型的表达水平。3)在体ACC神经元活动监测:利用在体钙信号成像方法,在小鼠进行社交行为时,同步进行光纤记录钙信号活动。利用多通道电生理记录结合光遗传学刺激的方法,观察不同光遗传学激活频率对ACC神经元活动的影响。4)在体ACC神经元活动调控:利用AAV-Ca MKIIa-Ch R2-EYFP/AAV-Ca MKIIa-Np HR-EYFP病毒载体进行ACC局部表达光敏感通道,通过光纤植入进行在体光遗传学调控。利用DREADDs病毒载体进行ACC局部表达h M3Dq,腹腔注射CNO进行在体化学遗传学调控。5)ACC神经元局部敲除Shank3:基于CRISPR/Cas9技术,利用AAV-CMV-Sa Cas9-sg RNA病毒载体进行ACC局部注射,特异性敲除ACC神经元Shank3。6)ACC锥体神经元Shank3重表达:基于Cre/loxp系统,利用Shank3fx/fx转基因动物,局部注射AAV-Ca MKIIa-cre-GFP病毒载体,特异性在锥体神经元中重新表达Shank3。7)药物调控AMPA受体功能:腹腔注射不同剂量CX546,或ACC埋置双侧套管后局部给药。8)动物行为学检测:利用三箱、小鼠直接社交接触实验检测小鼠社交行为能力;使用连续录制结合视频分析方法检测小鼠刻板理毛行为;采用旷场实验、高架十字迷宫实验、埋球、新物体识别等实验检测小鼠焦虑样行为。实验结果1)Shank3敲除小鼠ACC锥体神经元树突分支复杂度降低、树突棘密度降低且成熟树突棘比例下降;兴奋性突触后致密带长度及厚度降低。2)Shank3敲除小鼠ACC锥体神经元中m EPSCs频率及幅度降低、AMPA受体介导的兴奋性突触传递功能下降、Glu R1表达降低、长时程可塑性变化LTP受损。3)Shank3敲除小鼠ACC锥体神经元兴奋性突触驱动的动作电位产生能力降低、固有电生理特性没有显著改变、在体社交行为相关的神经元活动减少。4)光遗传学及化学遗传学激活ACC锥体神经元中能够改善Shank3小鼠社交行为障碍;光遗传学抑制ACC锥体神经元能使野生型小鼠出现孤独症样社交行为障碍。5)ACC局部条件性敲除Shank3能够诱导与Shank3全敲小鼠类似的突触功能损伤及社交行为异常表型,对刻板及焦虑行为无明显影响;ACC局部再表达Shank3能够部分挽救Shank3敲除小鼠的突触功能及社交行为障碍。6)全身或ACC局部给予AMPA受体正向变构调节剂CX546能够改善Shank3敲除小鼠兴奋性突触功能及社交行为障碍。结论总结本课题研究,我们发现Shank3敲除小鼠模型前扣带回皮层兴奋性突触出现显著损伤,其损伤造成的神经元活动降低与社交行为异常相关。通过多种手段分别干预ACC神经元活动、Shank3表达水平、AMPA受体功能,多维度证明了ACC功能障碍与孤独症模型小鼠社交行为的因果关系,为以ACC作为干预靶点的孤独症治疗提供了实验和理论依据。