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DNA中的磷酸二酯键异常稳定,这种稳定性被认为是维持生命及保持生物遗传信息的基本要求之一。然而,在细胞生命周期中的许多阶段,如:变异基因的切除与修复、整合以及信号转换等都需要高效水解DNA分子中磷酸二酯键。另外,在生物工程或分子生物学研究领域,对DNA进行各种操作以期得到某种符合要求的功能分子也需要利用某种物质高效率地断裂DNA。因此,合成能够在生理条件下高效切割DNA的小分子有望在分子生物学、生物工程以及药物化学研究领域得到广泛应用。据研究,自然界中有许多天然酶能够高效水解DNA分子,其中很多天然酶的活性中心含有多个金属离子,这些金属离子对其活性的发挥起着至关重要的作用。通过对天然酶的作用机理的深入研究,发现具有丰富的结构及反应性变化的金属配合物是最合适的人工模拟这些天然酶的化合物之一。多年来,这方面的研究一直是人们关注的热点之一。本论文设计并合成了三种新型双齿含酚配体及一种已报道的多齿三嗪配体,利用这些配体合成了五种含铜、锌离子的配合物,借助各种手段研究了这些化合物在水溶液介质中与DNA或其模拟物的作用,探讨了它们切割DNA或其模拟物的活性。
本论文共分为四章:
第一章总结了典型天然核酸酶及磷酸酯酶水解断裂底物的作用机理,阐述了这些天然酶的金属活性中心在酶切反应中可能发挥的作用。简要综述了模拟人工核酸酶及磷酸酯酶的目的、应用前景及其研究进展情况。重点描述了金属配合物作为核酸酶及磷酸酯酶模拟物的设计及其作用机理。归纳了含酚桥联配体及其双核配合物的合成。
第二章设计合成了一种新型带有醇羟基侧链的含酚配体2,6-bis{[(2-pyridylmethyl)(2-hydroxyethyl)amino]methyl}-4-methylphenol及其不对称双核锌配合物,[Zn<,2>(L<,-2H>)(AcO)(H<,2>O)](PF<,6>)·2H<,2>O(Zn<,2>L)。以DNA的双酯模拟物,
二-(4-硝基苯)磷酸酯为底物,在Tris-HCl/NaCl(pH=7.40)水溶液体系及以o-phthalic acid(pK<,a1>=2.89,pK<,a2>=5.51),MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonicacid,pK<,a >=6.2],Tris等为缓冲剂的无水有机体系中详细研究了Zn2L对其断裂的情况。实验表明,无论在含水或无水介质中,Zn<,2>L均能有效地断裂BNPP。在DH=7.20及50℃条件下,其断裂BNPP的催化速率常数为4.60 x10<,-6 >S<,-1>。通过ESMS、Uv-VIs、NMR等手段检测及动力学分析结果可推断出配合物Zn<,2>L中锌离子结合的脱质子醇羟基(zn-OR)为反应活性基团,并据实验结果提出了Zn<,2>L’断裂BNPP的反应机理。这在众多被生物无机化学界公认的以金属离子结合的羟基(M-OH)为活性基团的人工磷酸酯酶或核酸酶中是少有的例子之一。 另据研究表明,血蓝蛋白、酪氨酸酶、虫漆酶、抗坏血酸氧化酶等天然酶中均含有铜离子作为活性中心。合成铜配合物作为人工酶的研究有很多报道。含铜配合物具有适中的氧化还原电位,与核酸碱基有很高的亲和性。此外,还发现多核铜的配合物能够选择性地结合具有特殊构型的核酸并导致其断裂。新近研究还发现多核铜的配合物能通过选择性地氧化DNA的脱氧核醣而达到核酸链断裂的目的,其中有机配体在实现结合的选择性方面发挥重要作用。基于诸多铜配合物与DNA作用的研究成果,我们也开展了铜配合物的设计与合成方面的研究。其中在第三章中我们合成了另外两种类似2,6-bis{[(2-pyridylmethyl)(2-hydroxyethyl)amino]methyl}-4-methylphenol(L<2>)的新型含酚配体2,6-bis{[(2-aminoethyl)(2-hydroxyethyl)amino]methyl}-4-methylphenol(L<1>)和2,6-bis{[(2-hydroxybenzyl)(2_hydroxyethyl)amino]methyl}-4-methylphenol(L<3>)及其双核铜配合物。采用ESMS,UV-VIs,电位滴定等方法研究了三种配合物在水溶液中的性质,如配合物的形成,各物种的分布及其光谱行为等。在pH=7.42及室温条件下,双核配合物是主要、甚至是唯一存在的物种。以pBR322 DNA为底物探索了三种配合物在水溶液介质中对其切割的行为。实验结果表明,L<1>的双核铜配合物的DNA切割活性最高,L<3>的铜配合物的活性最低。通过对比分析,可推论三种配合物的活性差别可能主要取决于由配合物与底物的静电作用强弱、配体上取代基的大小及柔韧性、铜离子的配位稳定性等因素。
第四章利用已知配体2,4,6-tris(di-2-pyridylamine)-1,3,5-triazine(TDAT)与氯化铜反应合成了一种2:3型水溶性三核铜配合物[Cu<,3>(TDAT)<,2>Cl<,3>]Cl<,3>.2H<,2>O。以
triazine为母体的化合物主要用于超分子组装,其生物活性的研究也有报道,但以其为有机配体形成的金属配合物在生物体系中的研究尚无报道。本章采用UV-VIS,CD等光谱学手段研究了[Cu<,3>(TDAT)<,2>C1<,3>]Cl<,3>·2H<,2>O与小牛胸腺DNA的结合情况,测得了其结合常数为7.8×10<3>M<-1>。通过分析可判断出该配合物是通过非嵌入的方式与DNA非共价相结合。进而通过凝胶电泳方法以超螺旋质粒pBR322 DNA为底物探讨了[Cu<,3>(TDAT)<,2>Cl<,3>]Cl<,3>·2H<,2>O对DNA的切割活性,实验结果表明,该配合物能够高效氧化断裂DNA,根据自由基抑制实验结果可推论羟基自由基可能是:DNA断裂反应中的活性物种。