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目的DNA损伤是导致细胞凋亡的主要因素之一,减少DNA损伤可抑制细胞凋亡、死亡,是机体发生缺血性脑卒中后神经保护的重要机制。在缺血性脑卒中领域关于DNA损伤的研究较少。Netrin-1在神经系统的发育中扮演了重要的角色,除此之外,Netrin-1还可作为生存因子发挥作用。在缺血性脑卒中后,Netrin-1可能通过调节DNA损伤而减少细胞凋亡,减轻脑组织损伤,这一作用可能通过DCC/ERK信号通路实现。方法第一部分Netrin-1减轻MCAO大鼠缺血性脑损伤(1)线栓法建立大脑中动脉梗塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)大鼠模型,并予纹状体注射编码Netrin-1的腺相关病毒及对照空病毒,分别构建假手术组(Sham)、假手术+空病毒组(Sham+vector)、大脑中动脉梗塞组(MCAO)、大脑中动脉梗塞+空病毒组(MCAO+vector)、大脑中动脉梗塞+Netrin-1过表达组(MCAO+Netrin-1)干预模型。(2)通过磁共振检测各组模型梗死体积的变化,并运用mNSS评分及改良贴纸去除试验评价各组大鼠的行为学变化,使用Tunel染色评估大鼠脑组织的凋亡情况。第二部分Netrin-1通过ERK信号通路发挥抗凋亡作用(1)建立体外氧糖剥夺模型(Oxygen and Glucose Deprivation,OGD),并予编码Netirn-1的慢病毒转染细胞,构建对照组(CTL)、空病毒组(Vector)、Netrin-1过表达组(Lv-Netrin-1)及Netrin-1过表达+ERK信号通路抑制剂组(Lv-Netrin-1+U0126)。(2)通过流式细胞术及LDH释放实验明确Netrin-1对神经细胞凋亡及死亡的影响,通过彗星实验检测细胞DNA损伤情况,运用蛋白免疫印迹检测ERK信号通路的激活情况,并利用ERK信号通路抑制剂U0126检测ERK信号通路对DNA损伤的影响。第三部分Netrin-1通过DCC/ERK信号通路减轻DNA损伤(1)建立MCAO模型,分别构建假手术组(Sham),大脑中动脉梗塞+空病毒组(MCAO+vector)及大脑中动脉梗塞+Netrin-1过表达组(MCAO+Netrin-1)组,(2)采用免疫荧光标记,并用激光共聚焦显微镜检测DCC及Unc5B的表达情况。(3)建立OGD模型,构建对照组(CTL)、空病毒组(Vector)、Netrin-1过表达组(Lv-Netrin-1)、Netrin-1过表达+ERK信号通路抑制剂组(Lv-Netrin-1+U0126)及Netrin-1过表达+DCC中和抗体组(Lv-Netrin-1+anti-DCC)。(4)运用qPCR及Western blot、免疫荧光标记检测DCC的核酸及蛋白的表达水平;使用DCC中和抗体,检测其对ERK信号通路的抑制作用;运用ERK信号通路抑制剂U0126,检测其对下游蛋白p53及p21的蛋白表达情况的影响;使用电镜检测神经元线粒体形态变化情况。结果第一部分(1)MCAO+Netrin-1组脑梗死体积较MCAO组及MCAO+vector组减少,Netrin-1可减轻缺血性脑卒中的组织损伤(2)在mNSS评分及改良贴纸去除实验中,MCAO+Netrin-1组表现优于MCAO组及MCAO+vector。(3)Tunel检测结果显示,MCAO+Netrin-1组神经细胞凋亡率较MCAO组及MCAO+vector组明显减少。第二部分(1)Lv-Netrin-1组细胞凋亡率及细胞死亡比例较Vector降低,同时,Lv-Netrin-1组DNA尾长及拖尾率均低于Vector组。(2)神经元暴露于OGD环境下时Netrin-1及p-ERK在第6、12小时增加,24小时后表达量减少,而Netrin-1过表达组在OGD后24小时仍可持续激活p-ERK。(3)加入U0126后,Lv-Netrin-1组减少细胞凋亡及死亡的作用被抑制,同时其减少DNA损伤的作用也被抑制。第三部分(1)在MCAO模型中,MCAO+Netrin-1组DCC表达量较MCAO+vector组增加。在OGD模型中,Lv-Netrin-1组DCC表达量较Vector组增加。(2)DCC中和抗体可抑制Netrin-1对ERK的活化作用。(3)Lv-Netrin-1组p53及p21在OGD后表达较Vector组增高,线粒体肿胀程度较Vector组减轻,上述作用均可被U0126抑制。结论Netrin-1与受体DCC结合,激活ERK信号通路,上调DNA损伤修复蛋白p53及p21的表达,强化DNA损伤修复能力;通过减轻线粒体肿胀,维持线粒体形态,减少线粒体所致的DNA损伤。综上,Netrin-1可通过增加DNA修复能力及减少DNA损伤诱因发挥其在缺血性脑卒中的抗凋亡作用。