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小鼠胚胎干细胞(mESCs)是来源于囊胚内细胞团(ICM)的多能性细胞,其多能性的维持依赖于复杂的调控网络。在血清培养体系中,mESCs不是均匀表达所有多能性基因,部分基因呈异质性表达,由此导致mESCs处于初始态(Naive)和激发态(Primed)多能性状态的动态变化之中。多能性基因的异质性研究不仅有助于阐明mESCs维持naive多能性状态的分子机制,而且还将为naive多能性状态的人ESCs研究提供理论依据。Tbx3作为多能性转录因子,在mESCs中呈异质性表达,但其分子机制目前尚不清楚,本研究围绕Tbx3在mESCs中的异质性表达及其调控机制展开。为分离获得不同Tbx3表达量的mESCs用于Tbx3的异质性研究,本课题利用CRISPR/Cas9将绿色荧光蛋白(GFP)基因定点整合到Tbx3的终止密码子上游(Tbx3-C-GFP)。为观察体内Tbx3的表达模式,同时制备了 Tbx3-2A-GFP小鼠,即以2A短肽介导Tbx3和GFP的连接,保证了 Tbx3蛋白的完整性。利用流式细胞分选技术,通过分选GFP阳性和GFP阴性细胞,分别获得高水平(Tbx3high)和低水平(Tbx3low/no)表达Tbx3的mESCs。进一步的分析表明两者之间存在明显的表型差异:Tbx3high mES细胞高水平表达Klf4、Prdm14、Rex1、Esrrb等naive多能性状态特异基因,而Tbx3low/no mES细胞高水平表达Fgf5、Foxa2、T、Dnmt3b等胚层分化基因;与Tbx3low/no mES细胞相比较,Tbx3high mES细胞克隆形成率高、细胞增殖速率快、G0/G1期短、高水平表达Cdk2、Ccnd3等促进G1-S期转换的基因;当去除LIF或添加视黄酸时,Tbx3low/nomES细胞更容易分化;分别将Tbx3high和Tbx3low/no mES细胞注射到囊胚中,Tbx3high mES细胞有着很高的胚胎嵌合能力,而Tbx3low/no mES细胞则很难嵌合到胚胎中。然而Tbx3high和Tbx3low/no mES细胞并不是稳定存在的,因为mESCs可以在这两种状态之间相互转换。以上结果表明Tbx3high mES细胞的多能性状态更接近于ICM,而Tbx3low/nomES细胞的多能性状态更接近于原始外胚层,Tbx3是mESCs处于naive多能性状态的重要分子标记。为揭示Tbx3在维持mESCs处于naive多能性状态的分子机制,本研究利用转录组测序技术(RNA-seq)分析比较了 Tbx3high和Tbx3low/nomES细胞的mRNA表达谱。Tbx3high mES细胞富集的基因主要涉及多能性维持,而Tbx3low/nomES细胞富集的基因主要涉及胚层分化。为进一步探索在naive多能性状态维持过程中受Tbx3直接调控的基因,本研究结合已发表Tbx3的染色质免疫共沉淀(ChIP-seq)数据进行深入分析,发现Tbx3可以直接激活Suz12的表达,Suz12是PRC2复合体的核心成员,Suz12表达的缺失可导致Fgf5、Fgf15、Otx2等早期胚层分化基因表达量的上调。进一步实验发现,Tbx3通过调控Nodal的表达来抑制Smad2蛋白的磷酸化水平。Smad2蛋白磷酸化水平的上调是Tbx3low/no mES细胞高水平表达中内胚层分化基因的主要原因,抑制TGF-β信号通路有助于mESCs多能性的维持。综上所述,本研究表明Tbx3是mESCs处于naive多能性状态的重要分子标记。在mESCs的naive多能性状态维持中,Tbx3有着双重作用:一方面通过激活Suz12来抑制早期胚层分化基因的表达,另一方面通过调控TGF-β信号通路来抑制早期中内胚层分化基因的表达。