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由于高质量生物药品和医学诊断的需求,转基因动物乳腺生物反应器的研究已经成为生物工程领域研究的热点之一;成为高效、高质量生产昂贵生物活性蛋白的有效途径之一。应用乳腺生物反应器生产人的重组蛋白较其他的生物学制备系统有产品活性高、成本低的优点,因而某些人的重组蛋白更适宜用乳腺生物反应器来生产。外源基因在转基因动物乳腺中特异性表达是转基因动物乳腺生物反应器的根本目的。有许多生物活性蛋白基因在乳蛋白调控序列的指导下已经在转基因动物乳腺中表达,其中应用较多的调控元件有:牛αs1-酪蛋白（bovineαs1-casein）、山羊β-酪蛋白（β-casein）、绵羊β-乳球蛋白（BLG）、小鼠的乳清酸蛋白（WAP）等。尽管已有应用这些调控序列实现乳腺特异性表达成功的事例,但大多数实验研究中,乳腺特异性表达的成功率低、乳汁中的表达水平低。已经发现某些非乳蛋白调控元件对乳腺特异性表达有明显的作用,如绝缘子、染色质开启子、增强子、核基质附着区和内含子等,其中起到重要作用的是转录和翻译调控因子。近年来,尽管乳蛋白启动子及其它表达调控元件已广泛应用于乳腺特异性表达,但相对低的表达水平和不稳定表达案例也较多。人巨细胞病毒（CMV）启动/增强子是广泛用于真核细胞表达的调控元件,早期的研究证明有提高转录水平的作用,但未见报道用于激活乳腺特异性表达。本研究应用人巨细胞病毒启动/增强子（Pcmv）与乳蛋白调控元件构建复合启动/增强子和人乳铁蛋白cDNA组成乳腺特异性表达载体。为了鉴定复合启动/增强子对转基因动物乳腺特异性表达水平的作用,我们构建了单一乳蛋白启动子与乳蛋白/Pcmv复合启动子两种不同类型的乳腺特异性表达载体。应用山羊β-酪蛋白、山羊β-乳球蛋白、αs1-牛酪蛋白为乳蛋白调控序列为乳蛋白调控序列;鸡β-珠蛋白（β-globin,隔离元件）、CMV启动/增强子和SV40polyA为非乳蛋白启动/增强子。以不同的乳蛋白调控序列与启动/增强子组合构建乳腺特异性表达复合启动/增强子（chimeric promoter/enhancer）,单一的酪蛋白启动子作为对照,与人乳铁蛋白cDNA组成乳腺特异性表达载体。共构建了7个乳腺特异性表达载体（BnF95,pBnCL14,pBnLC2G,pgCN/LF/g,pgCNCG/LF25,pbCN/LF,pbCNCS/LF36）,其中4个为复合启动/增强子型载体,另3个为单一乳蛋白启动子型载体。BnF95、pBnCL14和pBnLC2G载体用于转染山羊乳腺上皮细胞（goat mammary epithetical cells,GMECs）;pgCNCG/LF25和pbCNCS/LF36为复合启动/增强子型,其中pgCN/LF/g和pbCN/LF为单一酪蛋白启动子作为对照,用于制备转基因小鼠。泌乳山羊乳腺组织经Ⅰ型胶原酶消化分离乳腺上皮细胞,DMEM/F12培养液（10%FCS）传代培养,获得的乳腺上皮细胞最多可培养25代以上。采用分步胰酶消化法去除上皮细胞中所含的成纤维细胞,从而乳腺上皮细胞得到纯化。通过电转染法将含NEOτ标记基因的BnF95、pBnCL14和pBnLC2G外源基因导入23个山羊乳腺上皮细胞系,经G418筛选三周后,得到有抗性的转染细胞株,挑取单克隆细胞株进行增殖培养。共获得242株转染外源基因的细胞,有118株转染pBnCL14,82株转染BnF95,42株转染pBnLC2G基因构件。有3株转染pBnCL14基因的细胞进行nestedPCR整合检测,结果均为外源基因整合阳性。初步认为经G418抗性培养后获得细胞为整合细胞。对抗性培养阳性的细胞株应用催乳素进行诱导表达,收集48和72小时的诱导细胞培养液进行ELISA检测,其中有30株细胞的诱导液中检测出重组人乳铁蛋白,有4株转染pBnCL14基因细胞的表达水平达到10-50mg·L-1;另有22株细胞（9株/BnF95,7株/pBnLC2G）表达水平低于10 mg·L-1。通过G418筛选和诱导表达和ELISA检测验证具有表达功能的乳腺上皮将用于山羊体细胞克隆的供核细胞。pgCN/LF/g,pgCNCG/LF25,pbCN/LF,pbCNCS/LF36四个构件应用胚胎显微注射的方法制备转基因小鼠。应用PCR初步筛选整合小鼠,获得14只原代转基因小鼠,PCR产物序列分析显示转基因小鼠PCR检测产物与模板的同源率为99.95%～99.75,在PCR正常正确率范围以上。原代鼠与C57或ICR正常鼠交配,在出生的后代鼠中检出37只F1代转基因小鼠。获得的转基因母鼠用ELISA检测乳汁中重组人乳铁蛋白,并繁殖传代,获得F1、F2代转基因小鼠。复合启动/增强子构件指导人乳铁蛋白cDNA在原代转基因小鼠乳腺中重组人乳铁蛋白（rhLF）表达水平(2～8.1g·L-1)明显高于单一酪蛋白启动子构件(0～12mg·L-1),约10000倍。在所有转基因小鼠的血清和唾液中未检测（ELISA）出重组人乳铁蛋白（rhLF）。研究表明,酪蛋白/Pcmv复合启动/增强子不仅可提高转基因小鼠乳腺特异性表达水平,而且具有良好的乳腺组织表达定位性。近年来,对基因表达调控机制提出了一些新的看法,认为几乎所有的哺乳动物基因表达是由多个环节调控的,其中包括了转录、转录后加工、核输出和定位、mRNA分子的成熟、翻译和稳定性等。生物信息学分析显示Pcmv含有多个uORF和CCAAT增强子结合位点。Lodhi等（2003）认为uORF能介导编码mRNA翻译的作用,而CCAAT序列是增强子结合蛋白结合的位点。有研究报道,CCAAT位点结合增强子结合蛋白也可介导功能基因的表达,这一过程可能意味着在5’-UTR顺式调控元件,包括复合启动子中乳蛋白和CMV启动子序列能激活人乳铁蛋白cDNA在培养的山羊乳腺上皮细胞和转基因小鼠乳腺中表达。本领域的研究报道显示,尽管已有一些利用长片段调控元件获得高表达的事例,但更多的低表达案例使开发那些构建方便、片段长度短小、表达效率和表达水平高的乳腺特异性表达载体显得十分迫切。本研究的结果不仅实现了cDNA功能基因的高水平、高效乳腺特异性表达,而且其载体的构建简单方便。到目前为止,尚未见有应用乳蛋白/Pcmv复合启动子激活cDNA功能基因实现乳腺特异性高效表达的报道。