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目的:
模拟不同的自然环境,观察腺病毒气溶胶的粒级分布、感染力及活性的变化特征,建立病毒气溶胶的实验室工作模型。为探讨病毒气溶胶传播机制,发病机制及致病性提供有力的科学依据。
方法:
1.重组腺病毒气溶胶的发生
在2000L的腔室内紫外线消毒1h,通气30min后利用TK-3型微生物气溶胶发生器将储备腺病毒2ml(病毒浓度为105.8TCID50)喷雾10min,暴露在预先设定的实验条件下,等待一段时间(根据实验要求而定)。
2.采样及粒级分布分析
将6个含有2mlMEM培养液(含2％FBS,100IU青霉素,100IG链霉素)的100mm×20mm细胞培养皿依次放入FA-1型多级撞击式空气微生物采样器各级采集样品,采样流量为28.3L·min-1,采样时间为10 min。为防止把沉积在腔室地面的病毒气溶胶采集到样本中,故在地面铺上蘸有80％甘油的毯子。FA-1型多级撞击式空气微生物采样器,类似于国际上通用的6级Andersen微生物采样器。采用惯性撞击原理将悬浮在空气中的微生物粒子由大到小分级地收集到撞击板下的采样介质中。1到6级粒径分别为：7.0μm以上,4.7～7.0μm,3.3～4.7μm,2.1～3.3μm,1.1～2.1μm和0.65～1.1μm。因此,在采集病毒气溶胶的同时也将采集的颗粒按大小分开。
3.实时荧光定量PCR测定病毒基因组拷贝数
根据RDRADS带有绿色荧光蛋白报道基因选择pEGFP-C2(CVU57606)基因序列,用DNAClub软件进行引物设计。GFPF:TGCCCATCCTGGTCGAGCTGGFPR:CCGTAGGTCAGGGTGGTCAC。扩增片段为166 bp。通过BLAST(The Basic Local Alignment Search Tool)序列对比,未见相似同源序列。采用QIAamp DNA Blood Mini Kit依照试剂说明,吸取200μl采样培养液提取病毒DNA。定量PCR在25μl反应体系中进行,体系中含2×mastermix 12.5μl,GFP引物1μl,病毒DNA 4μl,RNase-free water 7.5μl,在Mx3000P实时荧光定量PCR仪上进行扩增,反应条件为：95℃预变性10min,95℃30s变性,55℃30s退火,72℃30s延伸,共做40个循环。熔解曲线：95℃下1min,55℃下30s,95℃下30s。每一检测样本设复孔,每次检测时提取标准病毒储备液病毒做标准曲线。
4.PK15细胞培养及病毒侵染测定
将采样后的平皿内培养液各吸取400μl接种于pk15细胞密度达80％的24孔板中,48h后在LEICA DM IRBE荧光倒置显微镜下观察绿色荧光,照相记录。
5.数据分析和统计学处理
实时荧光定量PCR检测结果,根据标准曲线由Mx3000P计算机软件计算后给出。PK15细胞绿色荧光每个孔取5个不同视野进行拍照,采用JD 801形态学图象分析软件进行计数取平均值。
结果:
1.在本研究所能控制的温度和相对湿度的范围内,在高温(大于29℃)和高湿(大于60％)的环境下,带有绿色荧光的PK15细胞数及FQ-PCR检测结果均提示所采集的病毒气溶胶主要分布在第6级(0.65～1.1μm),而在其它温度和相对湿度的条件下,腺病毒气溶胶主要分布在第5级(1.1～2.1μm)。当温度达到33.2℃时,六个级别的采样培养液感染的细胞内均未见绿色荧光,但FQ-PCR检测结果提示六个级别的病毒基因组拷贝数是存在的,且以第6级的拷贝数最多。
2.两种波长的紫外线照射腺病毒气溶胶时,带有绿色荧光的PK15细胞数及FQ-PCR检测结果均提示所采集的病毒气溶胶主要分布在第6级；波长为254nm的紫外线照射5min时,在显微镜下观察到的荧光数明显减少。波长为254nm紫外线照射30min时,6个级别的细胞内均未见绿色荧光。波长为365nm紫外线照射30min时,绿色荧光数仍较多。波长为254nm的紫外线照射30min时没有观察到有绿色荧光的细胞,但是FQ-PCR结果提示病毒基因组拷贝数仍较高。
3.腺病毒在空气中的停留时间分别为5min、30min、1h、2h、3h、5h时,带有绿色荧光的PK15细胞数及FQ-PCR检测结果均提示所采集的病毒气溶胶主要分布在第5级,没有出现粒级变化。但是在腺病毒停留时间为3h、5h时,六个级别的采样培养液感染的细胞内均未见绿色荧光,FQ-PCR检测结果提示病毒基因组拷贝数仍较高。
4.在8、9月份,带有绿色荧光的PK15细胞数及FQ-PCR检测结果均提示所采集的病毒气溶胶主要分布在第5级。而在10、11月份,检测结果提示所采集的病毒气溶胶主要分布在第6级。灰霾天气条件下采样,带有绿色荧光的PK15细胞数及FQ-PCR检测结果提示所采集的病毒气溶胶主要分布在第6级。
5.燃烧阴香、马尾松、香烟的实验均是在11月份进行的,带有绿色荧光的PK15细胞数及FQ-PCR检测结果均提示所采集的病毒气溶胶主要分布在第6级。
结论:
1.实验发现,带绿色荧光蛋白的腺病毒直径与其空气动力学直径有很大差异,表明带绿色荧光蛋白的腺病毒在空气中是以与其他颗粒相结合的形式存在。腺病毒的活性随温度升高而降低。随着腺病毒在空气中停留时间的延长,病毒活性逐渐降低。
2.波长为254nm的紫外线照射比365nm的紫外线灭活腺病毒气溶胶的效果更著。两种波长的紫外线照射对腺病毒气溶胶的粒级分布没有显著影响。病毒基因组的存在并不能代表病毒有感染力。