背景结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是世界范围内发病率和死亡率都很高的恶性胃肠道肿瘤之一。近年来,CRC已被列为第三大常见癌症。虽然在CRC的预防、诊断和治疗方面均取得了一定的进展,但转移和复发仍是CRC治疗成功的主要问题。肿瘤干细胞最近被认为在CRC的病因中起着重要作用,多种因素参与了CRC的异质性和复发。肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）已被认为是一种赋予多种癌症表型和功能异质性的细胞机制。尽管肿瘤干细胞在癌症中所占比例很小,但它们仍被认为是包括CRC在内的各种癌症的预后和治疗复发面临的主要威胁。CRC干细胞（CR-CSCs）具有其他实体瘤干细胞的主要生物学特性。多项研究表明,人类结直肠癌中存在CRC干细胞,它们对临床肿瘤进展、化疗耐药和治疗失败均有影响。在过去的几年中,许多表面标记物已被提出用于大肠癌干细胞的鉴定和表征,包括CD44、CD133、CD166、Lgr5、ALDH、Nanog、Sox2、Oct-4。然而,在CRC中鉴定癌症干细胞仍然是一个困难的挑战。赖氨酸特异性脱甲基酶2B（KDM2B）是含有Jmj C结构域的组蛋白去甲基化酶（JHDM）家族的成员,已知其作为肿瘤抑制基因或癌基因发挥作用。KDM2B参与细胞分化、细胞衰老和干细胞自我更新等一些细胞过程。KDM2B基因的表达也与泌尿生殖系统异常、智力迟钝综合征和肿瘤等异常有关。据报道KDM2B基因在乳腺癌、卵巢癌和胶质瘤中的表达增加。同时,KDM2B可降低肿瘤细胞中多种因子的表达。这些因子在肿瘤细胞的存活、生长、侵袭和转移中起着重要作用。除此之外,KDM2B还被报道在某些癌症中可以控制肿瘤干细胞的自我更新。然而,KDM2B对CR-CSCs的影响及其机制尚不清楚。zeste同源物2增强子（Enhancer of zeste homolog 2,EZH2）是PRC2的一个组成部分,介导H3K27的甲基化,在维持胚胎干细胞的多能性和可塑性方面发挥作用,它是癌症发生和进展的重要调节因子。抑制EZH2表达可影响肿瘤细胞的增殖和侵袭。因此。EZH2的表达受多种致癌转录因子和癌症相关的非编码RNA的调控,这些转录因子和RNA对细胞增殖、肿瘤发生和干细胞维持至关重要。此外,研究表明EZH2的抑制和敲除显著降低了CSCs的致瘤性。据报道,在某些异常情况下,EZH2基因的表达受KDM2B调控。然而,在CRC中,它们之间的关系还没有完全阐明。KDM2B和EZH2在维持CSC的自我更新能力和致瘤能力方面起着重要作用,但这些基因在CRC中的生物学功能尚不清楚。已有几种通路被提出参与CRC干细胞的调控,包括ERK通路、Egfr/Akt/Nf-κB通路。PI3K/AKT信号通路在肿瘤发生发展中的作用已被广泛报道。这种信号在癌症中至关重要,因为它促进细胞生长和存活。除了在实体瘤中发挥作用外,PI3K/Akt通路在癌症干细胞中也发挥了重要作用。已有研究报道PI3K/Akt通路在结肠CSC的成球和生长中起重要作用,这代表了CSC的干性和增殖特性。因此这个特殊信号通路仍然是癌症治疗的一个机遇和挑战。目的1.确定KDM2B基因表达在CRC细胞进展和CRC干细胞特征中的功能作用。2.通过激活PI3K/AKT信号通路,证实KDM2B与EZH2的调控相关性,并通过CRC细胞的体外自我更新能力,确定其对CRC干细胞特性的影响。3.探讨KDM2B在体内的作用与表达情况。方法1.采用免疫组化（IHC）方法检测正常组织和肿瘤组织的蛋白表达水平。2.在CRCHT-29和DLD-1细胞系中,通过干扰小RNA（si RNA）对KDM2B进行瞬时下调。使用lipofectamine 2000将细胞分为3组:（1）si KDM2B#1,（2）si KDM2B#2和（3）非特异性si RNA（NC）。3.在HT-29和DLD-1细胞系中使用慢病毒载体实现KDM2B和EZH2的稳定下调。将细胞分为4组:（1）sh RNA-KDM2B组,（2）sh RNA-EZH2组,（3）阴性对照组（NC）,（4）未转染组为对照组。4.RT-qPCR检测瞬时稳定转染后KDM2B m RNA表达水平。Western blot检测KDM2B、EZH2、CD133、CD44、ALDH1、P21、Cyclin D、P27、PI3K、p PI3K、AKT和p AKT蛋白水平。5.为了确定KDM2B对HT-29和DLD-1细胞系增殖能力的影响,我们进行了CCK-8、集落形成和彗星试验。6.为了确定KDM2B基因表达是否与CRC干细胞特征相关,我们测定了成球试验和HT-29和DLD-1细胞系中CRC干细胞标志物（CD133、CD44、ALDH-1）的表达。7.为了确定KDM2B对EZH2转录的调控作用,我们通过细胞质和核蛋白分离实验分析了KDM2B对EZH2细胞质和核蛋白水平的影响。8.采用磁选分离法从HT-29细胞中分离干细胞CD133+/CD44+和CD133-/CD44-亚群。9.采用免疫荧光染色（IF）检测KDM2B和EZH2对CRCHT-29和DLD-1细胞以及肿瘤干细胞CD133+/CD44+和CD133-/CD44-亚群的影响。10.通过划痕创面愈合实验和Transwell迁移和侵袭实验,评价KDM2B和EZH2对HT-29和DLD-1细胞迁移和侵袭潜能的影响。11.将转染KDM2B后的DLD-1细胞和未转染的DLD-1细胞分别接种于BALB/c裸鼠体内,观察KDM2B对CRC体内致瘤性的影响。结果（1）IHC评分显示,KDM2B基因在大肠肿瘤组织中的表达高于癌旁正常组织（P<0.05）,且I-II期和II期KDM2B的表达水平高于II-III+III期（P<0.05）。临床特征与KDM2B基因表达的相关性分析表明,KDM2B的过度表达与肿瘤分期（P=0.012）和TNM（肿瘤/淋巴结/转移）分型（N:P=0.033,T:P=0.029,<0.05）呈正相关,而与M无显著性差异（P>0.05）。（2）Western blot结果显示,CRC细胞（HT-29、ROK、LOVO和DLD-1）中KDM2B蛋白表达高于正常上皮细胞（CCD841Co N）。Western blot和qPCR进一步证实了KDM2B的转染效率。。结果表明,与正常对照组相比,si KDM2B#1和si KDM2B#2组KDM2B蛋白和m RNA水平显著降低（P<0.01）。使用GAPDH和β-微管蛋白对收集的定量数据进行标准化。（3）CCK-8实验显示si KDM2B#1和si KDM2B#2组HT-29和DLD-1细胞增殖率较NC组显著降低（P<0.01）。在HT-29和DLD-1细胞系中,si KDM2B#1组（334±11.31,672±5.65）和si KDM2B#2组（267±18.38,616±55.86）的平均集落数明显低于NC组（470±11.31,789±25.46）（P<0.01）。此外,彗星实验显示KDM2B基因敲除可导致HT-29和DLD-1细胞DNA损伤。结果显示,与阴性对照组（2.13±0.52,5.09±9.03）相比,si KDM2B#1组（69±8.41,68±6.84）、si KDM2B#2组（78.42±3.32,73.11±9.03）彗星尾增加（p<0.001）。增殖蛋白研究表明,与NC相比,KDM2B基因敲除后P21和P27的表达增加,而cyclin D的表达降低。（4）为了确定CRC中KDM2B的下调是否与干细胞样特性有关,我们进行了成球试验。Western blot结果显示,与贴壁细胞相比,KDM2B蛋白在球形细胞中的表达水平更高。此外,成功下调HT-29和DLD-1细胞KDM2B后,si KDM2B#1组（23±2.82,30±2.12）、si KDM2B#2组（27±2.83,37±2.12）与NC组（57±4.25,28±3.54）相比,球径减小（P<0.05）。在平均球数上也得到了类似的结果,si KDM2B#1组（10±1.41,12±2.83）、si KDM2B#2组（13.5±2.12,12±1.41）和NC组（23±3.54,28.5±3.54）。此外,Western blot显示KDM2B的下调能够降低包括CD44、CD133和ALDH-1在内的大肠癌细胞干细胞标志物的表达。（5）荧光显微镜和q RT-PCR证实KDM2B稳定下调。结果表明,90%以上的转染细胞在荧光显微镜下呈绿色荧光,两种细胞KDM2B的m RNA表达水平均较低（p<0.001）。在KDM2B稳定下调后,我们通过western blot、免疫荧光等证实EZH2和KDM2B之间的关系,结果表明,KDM2B的下调在蛋白水平上显著降低了EZH2的表达（p<0.05）,KDM2B的下调降低了细胞质中EZH2的蛋白水平,增加了细胞核的水平。此外,为了探讨KDM2B和EZH2是否能调控PI3K/Akt信号通路,我们检测了KDM2B和EZH2对CRCHT-29和DLD-1细胞PI3K/Akt信号通路下游蛋白的影响。结果表明,下调HT-29和DLD-1细胞KDM2B和EZH2的表达,可降低p PI3K和p AKT的表达,增加PI3K和AKT的表达（P<0.01,P<0.05）。（6）CRC干细胞研究表明,干细胞分离后,CD133+/CD44+细胞群中KDM2B和EZH2的蛋白水平显著高于CD133-/CD44-细胞。在成功下调CD133+/CD44+细胞的KDM2B和EZH2后,我们观察到,与对照组和NC组相比,sh KDM2B和sh EZH2组的成球形成分析结果显示球体数量显著减少。除成球实验外,蛋白质研究表明KDM2B和EZH2基因敲除后,CD133+/CD44+细胞AKT、PI3K表达增加。表面标志物CD133、CD44和ALDH-1在sh KDM2B和sh EZH2中的表达也低于对照组和NC组。（7）划痕愈合实验表明,sh KDM2B和sh EZH2组细胞对HT-29和DLD-1细胞的损伤面积的阻滞作用明显优于对照组和NC组（P<0.01）。sh KDM2B-HT-29组（42.0±5.66）、sh EZH2-HT-29组（40.0±7.07）、sh KDM2B-DLD-1组（52.0±5.66）、sh EZH2-DLD-1组（48.0±1.41）的移行细胞数均显著低于对照组（91.0±4.94,110.5±3.54）（P<0.01）。Transwell侵袭实验结果相似,sh KDM2B-HT-29（33.5±7.78）、sh EZH2-HT29（30.5±2.12）和sh KDM2B-DLD-1（37.0±2.82）、sh EZH2-DLD-1（33.0±2.83）组的侵袭细胞数较对照组减少（65.0±5.65,70.0±4.24）（P<0.01）。（8）KDM2B转录降低了CRC细胞中EZH2的表达,我们分析了同一队列KDM2B TMA切片和特异性抗EZH2抗体免疫染色中EZH2的蛋白水平。结果表明,EZH2在肿瘤细胞核内高表达,Pearson相关性显示EZH2与KDM2B表达的CRC人类组织呈正相关（P<0.001）。（9）敲低KDM2B可抑制接种小鼠肿瘤的生长。体内研究显示,接种sh KDM2B的小鼠肿瘤生长受抑制,而接种未经处理的DLD-1细胞（对照）和NC接种的小鼠肿瘤生长则显著增加。接种sh KDM2B组4周后肿瘤体积为68.80±17.18,对照组和阴性对照组分别为278.05±42.70;251.07±22.42（P<0.0001）。此外,组织样本的蛋白印迹结果显示,与对照组和阴性对照组（P<0.05）相比,EZH2在sh KDM2B组中的蛋白质水平明显下降。免疫组织化学结果显示,与对照组和NC组小鼠的组织样本相比,sh KDM2B组肿瘤细胞KDM2B和EZH2的表达强度均降低。这些发现与体外结果一致。结论（1）与正常组织相比,KDM2B在CRC组织中高表达,与临床分期、TNM分期密切相关。（2）下调KDM2B降低CRC细胞活力,诱导DNA损伤,提示KDM2B可能是一种致癌基因。（3）下调KDM2B降低了CRC细胞成球,降低了CRC干细胞表面标记物CD133、CD44、ALDH-1的表达,提示KDM2B对大肠癌干细胞具有调节作用。（4）内源性KDM2B转录下调可降低EZH2的表达,可能激活PI3K/AKT通路。敲除KDM2B和EZH2可减少CRC细胞的迁移。KDM2B和EZH2通过调节PI3K/AKT信号通路,在体外维持CSC样细胞中不可或缺。CRC组织中EZH2的表达与KDM2B呈正相关,两者在CRC的进展中起重要作用。（5）体内研究结果显示,KDM2B在CRC细胞中的致癌作用以及KDM2B与EZH2的关系。抑制KDM2B表达,可抑制接种sh KDM2B组小鼠肿瘤的生长。此外,KDM2B似乎在体外和体内均可调节EZH2表达。综上所述,我们的结果显示KDM2B是CRC细胞和CRC干细胞中重要的致癌基因,KDM2B与EZH2的功能关系对CRC和CRC干细胞提供了新的治疗思路。