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目的:新疆细毛羊是我国著名的毛肉兼用型羊品种,新疆细毛羊具有抗病力强,食欲旺盛,耐粗饲等特点,在我国分布广泛,毛的品质和产毛量较高,具有重要的经济价值,到目前为止尚未明确报道该品种携带FecB多胎基因;湖羊是我国著名的多胎品种,据报道湖羊的多胎性能是由于携带FecB多胎基因的结果。本实验欲通过转基因方法获得表达湖羊的FecB基因的新疆细毛羊重构胚胎,为获得高繁殖力的新疆细毛羊奠定基础。 方法:(1)用TRIzol法提取了湖羊卵巢总RNA,通过反转录得到了湖羊卵巢cDNA,以cDNA为模板通过PCR扩增得到了FecB基因;(2)经过T/A克隆将FecB基因与T载体连接,构建了克隆载体,然后双酶切克隆载体得到FecB基因,将FecB基因与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建了真核表达载体;(3)用组织块法分离了新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,通过脂质体转染将携带有FecB基因的真核表达载体pEGFP-N1-FecB转入到新疆细毛羊胎儿成纤维细胞中,得到了稳定表达该基因的成纤维细胞;(4)采集了绵羊的卵巢,通过切割法得到了绵羊的卵母细胞,通过核移植将稳定表达FecB基因的成纤维细胞移入卵母细胞中,获得了表达有FecB基因的新疆细毛羊重构配。 结果:(1)成功克隆了湖羊的FecB多胎基因,经测序与GenBank已公布的Booloola羊的FecB多胎基因的序列完全一致;(2)酶切与测序结果表明本实验成功构建了pEGFP-N1-FecB真核表达载体;(3)获得了表达湖羊FecB基因的新疆细毛羊成纤维细胞;(4)得到了表达湖羊FecB基因的具有绿色荧光的新疆细毛羊重构胚胎。 结论:(1)在筛选过新疆细毛羊胎儿成纤维细胞观察到较强绿色荧光,FecB基因在新疆细毛羊胎儿成纤维细胞中表达良好;(2)转基因的新疆细毛羊重构胚表达绿色荧光,发育良好,可以用来做胚胎移植。