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随着农业现代化进程的加快和和土地利用率的增高,全世界土壤盐渍化现象愈加严重,农业经济与环境安全正面临着严峻的挑战。我国境内土壤的盐渍化问题严重,同时耕地盐渍问题也随之严峻。目前,种植耐盐植物被认为是改良盐碱地最经济且可持续的方法。对于多样的的土壤和气候类型,葡萄具有较强的适应性。同时,葡萄耐盐碱能力较强。因此,针对葡萄耐盐的内在生理机制进行研究,培育高耐盐的砧木,对国内盐碱地的开发和利用有重要价值。葡萄的根系可以限制有毒离子,这也是葡萄抗盐的一个重要原因。但毒害离子如何被限制的机理尚未研究清楚。本实验利用耐盐葡萄品种Crimson Seedless和盐敏感葡萄品种1103P进行耐盐的机理探究。通过对该基因进行生物信息学分析以及盐胁迫下该基因过表达植株和野生型植株在萌发期、苗期的各项生理指标进行测定和比较,分析其在植物抗盐中的作用。主要实验结果如下:1. 通过葡萄根部栓质层特异性染色观察确定了根部栓质层参与葡萄拒盐对50 m M Na Cl处理前后的Crimson Seedless和1103P根部距根尖20、30、40mm处进行徒手切片,然后进行染色。对染色结果进行观察,栓质层经Na Cl处理后有增厚现象。其中,而盐诱导的栓质层加厚现象在Crimson Seedless当中尤为明显,而在1103P中稍弱。这些结果表明,葡萄根部栓质层可能参与了其拒盐作用。2. 利用荧光定量PCR进行了葡萄耐盐研究及相关关键基因的筛选首先,对Crimson Seedless和1103P进行盐处理;然后,对处理前后的根、茎、叶三部位取材并提取RNA并对10个栓质相关基因进行了荧光定量PCR测定。结果显示,在耐盐品种Crimson Seedless中,栓质相关基因在对照组中表达量较低,盐胁迫后KCS11-2、KCS11-3、KCS4均呈现显著的上调表达,其中KCS11-2的上调表达与根组织的特异性密切相关。在盐敏感品种1103P中,栓质相关基因在对照组中即呈现较高的表达量,且呈现根特异性。盐胁迫后根中各相关基因均有小幅上调,但上调程度远不及Crimson Seedless。综上,选定VvKCS11-2为兴趣基因进行后续研究。3. 分别在Crimson Seedless和1103P中克隆获得其全长,并根据序列进行VvKCS11-2生物信息学分析。首先,在Crimson Seedless和1103P中进行VvKCS11-2的全长克隆。序列比对两条VvKCS11-2结果为氨基酸序列仅一处差异。根据序列VvKCS11-2,通过Ex PASy、SMART、TMHMM等进行分析,奠定了VvKCS11-2研究的理论基础。4. 过表达VvKCS11-2拟南芥株系的获得及其耐盐性分析将从Crimson Seedless中获得的VvKCS11-2基因全长经双酶切后正向连接到p RI101表达载体上,过表达载体p RI101-VvKCS11-2的构建。随后将p RI101-VvKCS11-2进行GV-3101的转化。将阳性GV-3101-p RI101-VvKCS11-2进行野生型的侵染,拿到过表株系。将过表达株系和野生型分别用0、75m M、100m M、125m M Na Cl处理,这些处理均不同程度的抑制了拟南芥的鲜重、生长表型和主根长度;而这些处理对野生型的抑制效果更明显,说明在萌发期过表达的拟南芥相比于较野生型的拟南芥,其耐盐性更强。不同株系幼苗期拟南芥经用0、100m M Na Cl处理后,叶片中的离子含量(主要包括Na~+和K~+)、脯氨酸含量及MDA的含量等生理指标被测定出来。实验结果表明,经过盐处理,过表达株系叶片中含有较高的K~+而Na~+的含量较低,K~+/Na~+值较大;过表达组中MDA含量较低,说明过表达株系在幼苗期有较强的耐盐能力。这些结果表明,VvKCS11-2过表拟南芥株系可以通过减轻离子毒害、增加脯氨酸等渗透胁迫物质等增强对盐胁迫的耐受能力。5. 纯合突变体的筛选并分析了其耐盐性拟南芥atkcs11(atkcs11)纯合突变体经“三引物”法筛选得到。而atkcs11是关键基因的同源基因。然后,通过Na Cl的处理,发现野生型比kcs11突变体生长更好。0、75m M、100m M、125m M Na Cl浓度处理下突变体株系拟南芥和野生型,它们在表型生长、鲜重和主根长度均受到了不同程度的抑制。与野生型株系相比,突变体株系受抑制的程度更强,说明突变体株系在萌发期耐盐能力相对较弱;测定0、100m M Na Cl处理幼苗期不同拟南芥株系叶片中的离子含量(Na~+和K~+)、MDA的含量及脯氨酸的含量等生理指标。实验发现,在盐处理下,突变体叶片内能保持较高的K~+和较低的Na~+,维持较低的K~+/Na~+;突变体株系中MDA的含量高于野生型拟南芥,而其中脯氨酸的含量低于野生型拟南芥,表明突变体拟南芥株系在幼苗期耐盐能力相对较弱。这些结果表明栓质层在植物耐盐中有积极的意义。