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目的:采用全细胞膜片钳技术对豚鼠Oddi括约肌(Sphincter of Oddi,SO)钙离子通道进行研究,探索SO平滑肌细胞钙通道类型,以进一步为SO的运动机制及SO相关的良性胆胰疾病治疗提供电生理基础。 方法: 1.标本的制备:将豚鼠SO段置于含有胶原酶II和木瓜酶的消化液中,分离获得单个SO平滑肌细胞,37℃Hepes缓冲液中保存备用。 2.细胞封闭与膜片钳全细胞记录:选取合格的细胞作为研究对象,通过电极拉制,细胞封接,形成高阻抗封接,电极施加负压吸破细胞膜,形成全细胞膜片钳记录模式,脉冲信号由pulse+pulsefit软件(HEKA,version8.3,法耳次,德国)控制,通道信号用EPC-9片钳信号放大器(HEKA,法耳次,德国)放大,通过Ag-AgCl电极丝和填充电极内液的微电极导入细胞,产生的电流信号通过EPC-9转换,被pulse+pulsefit软件所收集、分析,收集到的数据用Origin7.5拟合,记录SO细胞钙通道(Ica-L)及不同浓度Nifedipin下SO细胞钙通道(Ica-L),以不同电压下的ICa-L强度绘制成I-V曲线。 结果: 1.SO平滑肌细胞电压门控的钙通道(Ica-L):将细胞钳制电压在-90mV~+40mV之间,电流一般在6-12ms时出现,在原始I-V曲线中0mV达到最大峰值,最大峰电流密度值(pA/pF)为(-9.15±1.01,n=10 cells),并且具有时间、电压依赖性的激活和失活的特性,失活速度较缓慢,在-50mV处翻转。 2.不同浓度 Nifedipin对SO平滑肌细胞电压门控的钙通道(Ica-L)的影响:细胞外灌流0.1μmol/L、1.0μmol/L、5μmol/L和10μmol/L的nifedipin药物,钳制电压在-90mV~+40mV之间,当钳制电压为0mV时SO平滑肌细胞的Ica-L峰电流密度值(pA/pF)分别,-8.09±5.91,-4.12±2.25,-2.05±1.31,-1.38±0.81,由此可见nifedipine可显著抑制内向电流,10μmol/L Nifedipine几乎可完全取消内向电流。膜片钳技术对指令电压为-60~+40mV时10μmol/L NifedipineSO平滑肌细胞内Ica-L峰值进行检测,结果峰值较正常组明显降低(P<0.01)。 结论: 1.本实验应用膜片钳技术对急性分离的SO平滑肌细胞上的钙通道进行分析,确定豚鼠SO平滑肌细胞为L-型钙通道电流,L-型钙通道是SO细胞兴奋时细胞外钙内流的主要通道,并在SO兴奋过程中起关键作用,并为胆胰良性疾病提供一个新的治疗方向。 2.应用L-型钙离子拮抗剂Nifedipine可以减小SO钙离子电流,从而减弱SO收缩。临床上应用钙离子拮抗剂用于治疗因Oddi括约肌功能紊乱引起的腹痛,这也从基础的电生理研究中得到了证实。