人内源性逆转录病毒长末端重复序列结合体2（human endogenous retrovirus H long terminal repeat-associating 2,HHLA2）,是新发现的一个B7家族成员。HHLA2对于T细胞具有共刺激和共抑制双向调节作用:一方面可以刺激T细胞的增殖和细胞因子的产生,另一方面抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖和细胞因子的产生。此外,HHLA2还可促进血管生成,促进肿瘤生长、转移。已有多项研究证实HHLA2在多种恶性肿瘤组织中高表达,并且与肿瘤进展和转移密切相关。本研究首先通过生物信息学方法分析GEO数据库中肝细胞癌组织基因表达芯片发现HHLA2在肝细胞癌中显著差异表达及包含HHLA2在内的差异显著基因潜在的信号通路;然后课题组的前期研究初步证实HHLA2在肝癌细胞株Hep G2及小样本临床肝癌组织（n=55）中均高表达;并且其表达与临床分期、肿瘤分化程度及肿瘤侵犯邻近组织情况呈正相关。为进一步研究B7家族新成员HHLA2与肝细胞癌恶性生物学特征的关系及其对临床预后和肿瘤微环境的影响,探讨其作为预测肝癌预后的分子标记物及免疫治疗靶点的潜在价值。我们采用免疫组化方法检测202例HCC患者癌组织中HHLA2蛋白的表达情况及其与临床病理特征、生存预后的关系;然后构建HHLA2基因沉默细胞模型,探讨HHLA2对肝癌细胞增殖、黏附、细胞周期分布、凋亡和侵袭转移等恶性生物行为的影响,初步明确其生物学功能;最后探讨HHLA2蛋白与免疫微环境对肝细胞癌预后的影响。第一部分HHLA2蛋白在肝细胞癌组织中的表达及其对临床预后的影响目的:采用生物信息学分析方法初步分析HHLA2在肝细胞癌的差异表达及潜在的信号通路,同时探讨肝细胞癌组织中HHLA2蛋白的表达水平及其与临床病理特征和预后的关系。方法:1.采用R语言软件包对GEO数据库中肝细胞癌组织基因表达芯片GSE33006的数据进行生物信息分析,绘制差异表达基因热图并进行基因功能的注释GO通路分析。2.采用免疫组织化学方法检测HHLA2在202例肝细胞癌组织及50例正常对照肝组织中的表达情况及差异,分析HHLA2表达水平与肝细胞癌各临床病理因素间的关系及对临床预后的影响。结果:1.GSE33006芯片中显著差异表达基因的GO通路分析结果显示:包含HHLA2在内的显著差异表达基因参与免疫应答、趋化因子调节信号通路和细胞外基质构成信号通路。2.在202例肝细胞癌组织中HHLA2蛋白高表达103例（51%）,低表达99例（49%）。正常对照肝组织中HHLA2蛋白几乎未见表达。3.在肝细胞癌组织中HHLA2蛋白的表达水平与CNLC分期、肿瘤分化程度、肿瘤数目、微血管侵犯、肝被膜侵犯和血清GGT水平呈显著正相关（P0.05）。4.生存分析显示HHLA2高表达组患者DFS和OS明显低于HHLA2低表达组患者的DFS和OS（P<0.001）。5.COX比例风险回归模型结果显示,微血管侵犯、肿瘤大小、肿瘤数目、P53阳性率、Ki67阳性率和HHLA2表达情况均与患者预后相关,为HCC术后患者预后的独立预测因子。结论:1.HHLA2可能与肝细胞癌免疫微环境有关。2.HHLA2在肝细胞癌组织中的高表达与肿瘤CNLC分期、肿瘤分化程度、肿瘤数目、微血管侵犯、肝被膜侵犯和血清GGT水平密切相关。提示HHLA2促进肝细胞癌恶性生物学行为的发生。3.HHLA2高表达的肝细胞癌患者临床预后较HHLA2低表达的肝细胞癌患者更差,说明HHLA2是影响肝细胞癌不良预后的一项重要指标。4.HHLA2是影响肝细胞癌患者总生存的独立预后因素。因此,HHLA2蛋白可作为预测肝细胞癌患者预后的重要标志物。第二部分HHLA2对肝癌细胞恶性生物学行为的影响目的:探讨沉默HHLA2基因后对肝癌细胞株Hep G2在增殖、黏附、细胞周期分布、凋亡和侵袭转移等恶性生物行为的影响,初步明确其生物学功能。方法:1.采用慢病毒介导的RNAi技术构建稳定的Hep G2细胞的HHLA2基因沉默细胞模型,通过实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术筛选沉默HHLA2基因效果最好的sh RNA片段。2.采用CCK-8法检测抑制HHLA2基因表达后对Hep G2细胞增殖和黏附能力的影响。3.采用流式细胞仪器检测法检测抑制HHLA2基因表达后对Hep G2细胞周期分布和凋亡的影响。4.采用细胞划痕实验和Matrigel-transwell侵袭实验方法观察抑制HHLA2基因表达后对Hep G2细胞转移和侵袭能力的影响。结果:1.通过PCR和测序鉴定成功构建HHLA2-sh RNA-1、HHLA2-sh RNA-2、HHLA2-sh RNA-3这3组慢病毒重组载体,并经RT-PCR和Western blot方法检测筛选发现,HHLA2-sh RNA-1组的m RNA相对表达量最低（P=0.006）,HHLA2蛋白抑制率最高（P<0.0001）,故转染了HHLA2-sh RNA-1质粒慢病毒的Hep G2细胞作为实验组Hep G2-KD用于后续实验。2.CCK-8法检测结果表明,Hep G2-KD组的细胞增殖能力从第三天开始出现下降,与Hep G2-NC组对比差异具有统计学意义（P=0.018）;Hep G2-KD组黏附细胞数显著多于Hep G2-NC组（P=0.0017）。3.Hep G2-KD组的细胞的凋亡水平显著上升（P<0.0001）,G0/G1期和S期数目增加,G2/M期数目减少。4.划痕实验结果显示Hep G2-KD组Hep G2细胞48h的迁移率明显低于Hep G2-NC组Hep G2细胞的迁移率（P=0.0279）;Matrigel-transwell实验结果示Hep G2-KD组穿过小室迁移至下室的细胞数明显减少。结论:抑制HHLA2基因可以显著增加肝癌细胞黏附能力和促进细胞发生凋亡,同时降低细胞增殖能力、迁移及侵袭能力和诱导细胞周期停滞在G1/S期,提示HHLA2参与肝癌的发生发展。第三部分HHLA2与肝细胞癌的肿瘤免疫微环境相关性初步研究目的:利用生物信息学方法分析肝癌细胞癌中HHLA2潜在的信号通路,探讨HHLA2蛋白与免疫微环境对肝细胞癌预后的影响,为寻找适合HCC免疫治疗的新靶点和新策略提供实验基础。方法:1.采用Linked Omics数据库分析在肝细胞癌中与HHLA2转录表达相关的基因,并基于上述共表达基因进行GO功能和KEGG的富集分析。2.采用苏木精-伊红染色法和免疫组化方法检测202例HCC患者癌组织中TILs浸润程度和PD-L1的表达。3.采用Kaplan-Meier生存曲线分析TILs浸润程度、PD-L1蛋白表达与HCC患者生存预后相关性。4.采用Spearman秩相关分析HHLA2表达与TILs浸润程度、PD-L1表达间的相关性。5.构建基于HHLA2的表达水平与TILs浸润程度的HCC免疫微环境亚型,分析其对HCC预后的影响。结果:1.利用Linked Omics共获得在肝细胞癌中与HHLA2相关的19922个差异表达基因,从火山图中得到了与HHLA2表达最为密切的三个基因分别为TFF2、FABP6、PPP1R14D。2.GO功能分析显示了主要参与了免疫应答激活细胞表面受体信号通路、免疫应答调节细胞表面受体信号通路、免疫应答激活信号转导等与免疫相关的生物学进程;KEGG的通路分析显示了主要与免疫相关的通路有FcγR介导的吞噬作用、肿瘤坏死信号通路和T细胞受体信号通路有关。3.在202例HCC癌组织中,TILs少量浸润例数有31例（15.3%）,TILs中度浸润例数有107例（53.0%）,TILs高度浸润例数有64例（31.7%）;PD-L1蛋白阳性表达有66例（32.7%）,阴性表达有136例（67.3%）。正常对照肝组织中PD-L1蛋白较少见表达。4.生存曲线分析发现TILs高度浸润和中度浸润的HCC患者术后的DFS和OS明显长于TILs少量浸润的HCC患者的DFS和OS（P<0.001）。5.生存曲线发现癌组织PD-L1阳性表达患者术后DFS与PD-L1阴性表达患者的DFS间的差异无统计学意义（P=0.259）;PD-L1阳性表达患者的OS明显差于PD-L1阴性表达患者的OS（P=0.023）。6.Spearman秩相关分析结果显示HHLA2的表达水平与TILs浸润程度存在显著相关性（P=0.028）;但HHLA2的表达与PD-L1表达无显著相关性（P=0.057）。生存分析发现在TILs少量浸润和中度浸润的HCC患者中,HHLA2高表达会导致较差的总生存期;而对于TILs高度浸润的HCC患者,HHLA2的高低的表达对患者的总生存期无统计学差异。7.基于HHLA2的表达水平与TILs浸润程度将HCC免疫微环境分为四型:Ⅰ型为HHLA2-high TILs+（38.1%）,Ⅱ型为HHLA2-low TILs-（5.0%）;Ⅲ型为HHLA2-high TILs-（12.9%）;Ⅳ型为HHLA2-low TILs+（44%）。Ⅰ型患者的中位OS为49.5个月和Ⅳ型患者的中位OS为51.3个月,均明显长于Ⅱ型和Ⅲ型患者（中位OS分别为24.2个月和7.6个月）（P<0.001）。Ⅰ型和Ⅳ型患者的DFS（中位DFS分别为15.8个月和49.2个月）均明显长于Ⅱ型和Ⅲ型患者（P<0.001）。结论:1.生物信息学分析显示HHLA2可能通过免疫应答的生物学进程和FcγR介导的吞噬作用、肿瘤坏死信号通路、T细胞受体信号通路等参与并影响肝细胞癌免疫微环境。2.肝细胞癌免疫微环境中HHLA2表达与TILs浸润呈显著相关性,随着TILs浸润程度的增加,可抑制HHLA2高表达对肝细胞癌患者预后不良的影响。3.HHLA2-high TILs+和HHLA2-low TILs+是肝细胞癌免疫微环境中预后良好的的免疫亚型,提示有TILs浸润的肝细胞癌患者预后较好。