白细胞介素2(IL2)是一种具有广泛生物活性的细胞因子,它能够有效地提高机体的免疫功能.目前已证实,牛白细胞介素2(Bovine IL2,BoIL2)在牛的多种疾病预防与治疗中具有很好的作用.因此,研究利用基因工程的方法,在真核系统中表达牛白细胞介素2具有一定的经济价值和理论意义.巴斯德毕赤酵母目前已经成为分子生物学研究中,表达外源蛋白的一种重要工具.它不仅具有原核生物生长快、表达量高、操作简便的特点,又具备高等真核细胞的翻译后加工和修饰功能,所以此系统得到了广泛地应用.以利用含有强启动子P<,AOX1>和α-factor信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pPICZ α A,构建出BoIL2基因的重组质粒pPICZ α A-BoIL2.线性化的重组表达载体转化到巴斯德毕赤酵母X-33及KM71H中,筛选Zeocin高抗性酵母菌株,甲醇诱导目的蛋白表达.SDS-PAGE和Western blot鉴定表明,BoIL2以融合蛋白形式在胞内表达,但没能分泌到胞外.因为目的蛋白的C端带His-tag,故可用镍柱进行亲合层析纯化目的蛋白.利用IL2依赖性的小鼠CTLL2细胞检测纯化后融合蛋白的生物活性,结果表明没有切除信号肽的融合蛋白无生物活性.为探讨不同的信号肽对目的蛋白分泌的影响,该研究利用连续延伸PCR的方法构建了含有牛白细胞介素2天然信号肽的表达载体pPICZB-NS.为提高Kex2对α-factor的切割效率,又构建了保留Glu-Ala重复子的重组表达载体pPICZ α A-MG.再进行重组菌株的转化和高抗性的筛选,甲醇诱导蛋白表达.但在上清中仍检测不到目的蛋白,目的蛋白仍以融合蛋白的形式存在于胞内.总之,该研究通过不同构建策略的表达载体的构建,实现了目的蛋白在真核体系中的表达,但以融合蛋白的形式存在于胞内,通过不同信号肽和信号肽加工位点的构建,探讨了影响目的蛋白有效分泌的原因.