研究背景和目的胃癌(gastric cancer,GC)是世界十大恶性肿瘤之一,也是消化系统最常见的恶性肿瘤。根据世界卫生组织(world health organization, WTO)统计结果表明,日本、韩国和中国等东亚国家是胃癌高发区,而美国、新西兰和澳大利亚等国家是胃癌低发区。在世界范围内,胃癌的发病率位居恶性肿瘤的第四位,死亡率位居恶性肿瘤的第二位。在我国,胃癌的发病率和死亡率都位居恶性肿瘤的前列。根据全国范围的死亡原因调查发现,因恶性肿瘤死亡位居男性和女性死亡原因的第二位和第三位。虽然在近几十年来胃癌的基础和临床研究取得了一些进步,但是胃癌的诊断和治疗现状仍然不容乐观。胃癌患者的五年总生存率不到24%。大部分胃癌诊断时已经是中晚期,即使对其进行了以手术治疗为主的综合治疗,约60%的患者依然出现复发转移,这将严重影响胃癌患者的预后。胃癌侵袭转移的防治在很长一段时间内都是人类战胜胃癌必须要解决的重大问题。仅仅只针对胃癌原发病灶的治疗已经证实效果是不十分理想。需要在关注胃癌原发灶的同时,花大力气去探索胃癌侵袭转移的机制,能够找到新的诊断标志物,有利于胃癌的早期诊断；新的预后分子标记物,有利于胃癌患者预后的预测；新的治疗靶点,为胃癌患者的个体化治疗提供依据。这将对胃癌的诊断与治疗的进步奠定扎实的基础。非肌肉肌球蛋白Ⅱ (Nonmuscle myosin Ⅱ, NMⅡ)是肌球蛋白超家族中的一种,其包括三个亚型：NMⅡA、NMⅡB和NMⅡC,分别有MYH-9、MYH-10和MYH-14三种基因编码。NMⅡ是由3对多肽组成：两条分子量是230kDa的重链,两条20kDa的调节轻链(MLC20)和两条17kDa的必需轻链(MLC17)。目前的研究发现MYH-9在遗传性疾病的发生、血栓性疾病的发生、听力障碍、炎症和肿瘤的转移等方面都具有重要的作用。特别是在有关NMⅡA蛋白(MYH-9基因)在肿瘤发生发展中作用的研究越来越多。有研究发现,NMⅡA蛋白在食管癌中是高表达的,NMⅡA蛋白表达与转移性淋巴结数目、肿瘤分化和TNM分期密切相关,NMⅡA蛋白高表达的食管癌患者的5年总生存率明显下降;用RNAi技术干扰KYSE-510食管癌细胞的MYH-9基因后,发现干扰后KYSE-510食管癌细胞的迁移能力明显下降；S100A4蛋白在多种恶性肿瘤的侵袭转移过程中发挥了重要作用,有研究通过显微共聚焦显微镜观察发现,S100A4蛋白与NMⅡA蛋白的重链结合来发挥其生物学作用；MicroRNA Let-7f也是通过与干扰MYH-9基因的表达来抑制胃癌的侵袭转移。查阅文献发现,有关MYH-9基因在胃癌中的表达、作用及其机制的报道很少。因此,本研究旨在探讨MYH-9基因在胃癌发生发展中的作用。首先用半定量RT-PCR技术和Western blot技术检测MYH-9基因(NMⅡA蛋白)在胃癌组织中的表达情况；然后用免疫组织化学技术检测NMⅡA蛋白在胃癌组织的表达情况,并分析NMⅡA蛋白表达与胃癌患者临床病理学资料的关系和NMⅡA蛋白表达与胃癌患者预后的关系；最后,通过RNAi方法建立特异性敲低MYH-9基因的胃癌细胞株并对其进行体外的功能实验。由此探讨MYH-9基因在胃癌发生发展中的作用,寻找到胃癌相关的预后和转移标志物和阻断胃癌转移的可能靶点。方法1.MYH-9基因和NMⅡA蛋白在胃癌组织中的表达收集36组新鲜的胃癌及癌旁组织标本,采用半定量RT-PCR技术在mRNA水平检测MYH-9基因在14组胃癌及癌旁组织中的表达情况；同时用Westernblot技术在蛋白水平检测NMⅡA蛋白在36组胃癌及癌旁组织中的表达情况。2. NMⅡA蛋白表达与胃癌患者临床病理学参数及预后的关系采用免疫组织化学技术检测NMⅡA蛋白在96例胃癌患者的96个胃癌组织石蜡标本、30个胃癌癌旁组织石蜡标本和30个转移性淋巴结石蜡标本中的表达情况,并分析NMⅡA蛋白表达与胃癌患者临床病理学参数(包括性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、肿瘤分化、劳伦分型、肿瘤浸润深度、淋巴结转移状态、平均清扫淋巴结数目、平均转移性淋巴结数目、远处转移状态和TNM分期)之间的关系。分析NMⅡA蛋白表达与各类胃癌患者(包括胃癌患者、进行了根治性胃癌切除的患者、肠型胃癌患者、弥漫型胃癌患者、Ⅰ+Ⅱ期胃癌患者和Ⅲ+ⅣV期胃癌患者)预后的关系。3.MYH-9SiRNA的化学合成和筛选德国Qiagen公司化学合成MYH-9SiRNA,包括1个阳性对照：Hs-MAPK1-3;1个阴性对照：Ctrl-AllStars-1;2、MYH-9SiRNA:Hs-MYH-9-1和Hs-MYH-9-2。参考德国Qiagen公司提供的SiRNA/转染试剂比例,设计五种不同的SiRNA/转染试剂比例。设置5个实验组：第一组：SiRNA (75ng)／转染试剂(1.5μl)；第二组：SiRNA (75ng)／转染试剂(3μl)；第三组：SiRNA (37.5ng)／转染试剂(1.5ul)；第四组：SiRNA (37.5ng)/转染试剂(3μl)；第五组：肿瘤细胞组。采用阳性对照SiRNA (Hs-MAPK1-3)作为目的SiRNA,转入胃癌细胞中,于转染后48小时及72小时时间点收获细胞分别提取RNA和蛋白进qRT-PCR和Western blot分析,了解SiRNA (Hs-MAPK1-3)对胃癌细胞MAPK1基因表达量的影响,从而确定SiRNA/转染试剂最佳混合比例。设置5个实验组：空白组(肿瘤细胞组)；阴性对照组Ctrl-AllStars-1;阳性对照组：Hs-MAPK1-3;实验组1：Hs-MYH-9-1和实验组2：Hs-MYH-9-2。按上面确定的SiRNA/转染试剂最佳混合比例,分别转入胃癌细胞,于转染后72小时时间点时提取细胞蛋白和总RNA分别用Western blot和qRT-PCR分析,了解MYH-9SiRNA对胃癌细胞MYH-9基因表达量的影响,从而筛选出敲低效果最好的MYH-9SiRNA。4.MYH-9表达敲低对胃癌细胞生物学特性的影响采用半定量RT-PCR和Western blot技术分别检测了5种具有不同转移潜能的胃癌细胞株中MYH-9的表达并分析其含量与转移潜能的相关性,然后选择MYH-9高表达的并具有一定成瘤和转移能力的胃癌细胞株。将敲低效果最好的MYH-9SiRNA转染到胃癌细胞株中。应用细胞迁移、细胞侵袭和细胞粘附实验来观察MYH-9基因敲低前后胃癌细胞株生物学特性的变化。结果1.MYH-9基因和NMⅡA蛋白在胃癌组织中的表达半定量RT-PCR结果表明,有10组胃癌组织中的MYH-9mRNA表达量高于胃癌癌旁组(71.50%,10/14),进一步采用Mann-Whitney U检验进行分析,发现胃癌组的MYH-9mRNA相对表达量得分的平均秩次是19.21,而胃癌癌旁组的平均秩次9.79,两组MYH-9mRNA相对表达量得分的差异有统计学意义(U=32.00, P=0.002); Western blot结果表明,有26组胃癌组织中的NMⅡA蛋白表达量显著高于胃癌癌旁组(73.34%,26/36),进一步采用Mann-Whitney U检验进行分析,发现胃癌组的NMⅡA蛋白相对表达量得分的平均秩次是50.13,而胃癌癌旁组的平均秩次22.88,两组NMⅡA蛋白相对表达量得分的差异有统计学意义(U=157.50,P=0.000)。2. NMⅡA蛋白表达与胃癌患者临床病理学参数及预后的关系免疫组化结果表明,在30例胃癌癌旁组织中,NMⅡA蛋白在6例中无表达和24例中弱表达。在96例胃癌组织中,53例是肠型胃癌,43例是弥漫型胃癌。53例肠型胃癌,NMⅡA蛋白在28例中强表达,18例中中度表达和7例中弱表达。43例弥漫型胃癌,NMⅡA蛋白在25例中强表达,12例中中度表达和8例中弱表达。46例胃癌组织的SI<10,50例胃癌组织的SI≥10,用Mann-Whitney U检验分析,发现胃癌组中NMⅡA蛋白相对表达量得分9.53,显著高于胃癌癌旁组3.20(U=104.50,P<0.001)。肠型胃癌组中NMⅡA蛋白相对表达量得分8.91,显著高于胃癌癌旁组3.20(U=102.50,P<0.001)。弥漫型胃癌组中NMⅡA蛋白相对表达量得分9.93,显著高于胃癌癌旁组3.20(U=2.00,p<0.001)。无论在原发胃癌组织中是高表达或低表达,NMⅡA蛋白在30例转移性淋巴结组织中均是高表达。胃癌组NMⅡA蛋白表达得分与患者的性别(P=0.909)、年龄(P=0.884)、肿瘤大小(P=0.325)、肿瘤位置(P=0.534)、肿瘤分化程度(P=0.078)、劳伦分型(P=0.871)和清扫淋巴结数目(P=0.180)无显著相关。而与肿瘤浸润深度(P=0.026)、转移性淋巴结数目(P<0.001)、淋巴结转移状态(P=0.015)、远处转移状态(P=0.021)和TNM分期(P=0.004)密切相关。生存分析结果显示,NMⅡA蛋白高表达的胃癌患者中位生存时间为48.1月(n=50),而NMⅡA蛋白低表达的胃癌患者中位生存时间为67.0月(n=46),NMⅡA蛋白的表达与胃癌患者的不良预后有密切相关(p<0.001)；在行根治性胃癌手术的患者中,NMⅡA蛋白高表达的胃癌患者中位生存时间为49.5月(n=35),而NMⅡA蛋白低表达的胃癌患者中位生存时间为68.6月(n=41), NMⅡA蛋白的表达与胃癌患者的不良预后有密切相关(p=0.005)；在Ⅰ+Ⅱ亚组中(n=50),而NMⅡA蛋白高表达的胃癌患者的生存时间显著低于NMⅡA蛋白低表达的胃癌患者(p=0.012)；在Ⅲ+Ⅳ亚组中(n=46),NMⅡA蛋白高表达的胃癌患者的生存时间也显著低于NMⅡA蛋白低表达的胃癌患者(p=0.027)；在肠型胃癌亚组中(n=53),NMⅡA蛋白高表达的胃癌患者的生存时间与NMⅡA蛋白低表达的胃癌患者的生存时间的差异没有统计学意义(p=0.071)；在弥漫型胃癌亚组中(n=43),NMⅡA蛋白高表达的胃癌患者的生存时间与NMⅡA蛋白低表达的胃癌患者的生存时间的差异也没有统计学意义(p=0.112)。采用逐步回归法进行Cox模型分析,仅NMⅡA蛋白表达(p=0.000)、TNM分期(p=0.014)和淋巴结转移状态(p=0.000)可作为预测患者不良预后的独立指标。3.MYH-9SiRNA的化学合成和筛选MYH-9SiRNA(干粉状态)由德国Qiagen公司化学合成,包括1个阳性对照：Hs-MAPK1-3;1个阴性对照：Ctrl-AllStars-1;2个MYH-9SiRNA: Hs-MYH-9-1和Hs-MYH-9-2。参考德国Qiagen公司提供的SiRNA/转染试剂比例,设计五种不同的SiRNA/转染试剂比例,然后将SiRNA (Hs-MAPK1-3)转入五组胃癌细胞中后,分别在48小时和72小时时间点收获细胞并提取RNA和蛋白,分别经过qRT-PCR和Western blot分析,在48小时时间点,五种SiRNA/转染试剂比例下胃癌细胞MAPK1基因表达量没差异：在72小时时间点,第一组(SiRNA:75ng/转染试剂：1.5μl)的SiRNA(Hs-MAPK1-3)对胃癌细胞MAPK1基因的表达量最少,说明这个SiRNA/转染试剂比下SiRNA(Hs-MAPKl-3)对胃癌细胞MAPK1基因的敲低作用最强。将德国Qiagen公司设计的5种SiRNA在SiRNA:75ng/转染试剂：1.5μl条件下转入胃癌细胞株后,在72小时时间点收获细胞分别提取RNA和蛋白,经过qRT-PCR和Western blot分析结果表明,实验组1(Hs-MYH-9-1)敲低的胃癌细胞株中MYH-9基因的表达量最少。说明SiRNA (Hs-MYH-9-1)对胃癌细胞中MYH-9基因的敲低作用最强。4.MYH-9表达敲低对胃癌细胞生物学特性的影响半定量RT-PCR和Western blot分析表明,SGC-7901胃癌细胞株中MYH-9基因(NMIIA蛋白)的表达最高,而且SGC-7901胃癌细胞株是淋巴结来源。适合用于开展RNAi实验。迁移实验结果表明：与阴性对照组(SGC-7901/Ctrl-AllStars-1)细胞相比,SiRNA干扰组(SGC-7901/Hs-MYH-9-1)细胞的迁移能力减弱,两组之间的差异有统计学意义(P=0.000<0.05)。侵袭实验结果表明：与阴性对照组(SGC-7901/Ctrl-AllStars-1)细胞相比,SiRNA干扰组(SGC-7901/Hs-MYH-9-1)细胞的侵袭能力减弱,两组之间的差异有统计学意义(P=0.000<0.05)。粘附实验结果表明：与阴性对照组(SGC-7901/Ctrl-AllStars-1)细胞相比,SiRNA干扰组(SGC-7901/Hs-MYH-9-1)细胞的粘附能力增强,两组之间的差异有统计学意义(P=0.000<0.05)。结论1.MYH-9基因与胃癌进展密切相关,是促进胃癌侵袭和转移的重要基因。2.NMⅡA蛋白表达是预测胃癌患者不良预后的独立指标。本研究的创新之处：1.较系统的分析了MYH-9基因(NMⅡA蛋白)在胃癌中的表达。2.深入研究了NMⅡA蛋白表达在胃癌患者中的预后价值。3.利用化学合成的SiRNA,成功建立了MYH-9低表达的胃癌细胞株。4.初步研究了MYH-9基因与胃癌迁移、侵袭及粘附的相互关系。