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目的:优化改进牛津杯抑菌试验方法。采集育龄期女性阴道分泌物样本,从样本中分离、鉴定,并应用牛津杯法筛选出具有良好抑菌活性的乳杆菌种。结合传统表型试验与基因组学方法对有拮抗致病菌作用的分离株进行安全性评价,以期为临床诊疗感染性疾病提供新的思路与靶点。方法:1. 研究对象及标本采集采集100例2018年至2020年度,在石家庄长城中西医结合医院体检的,近一个月未服用抗生素,无肿瘤、乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒及艾滋病、糖尿病等恶性疾病、传染病或代谢性疾病病史的18岁至45岁育龄期女性的阴道分泌物,将收集到的分泌物接种于MRS液体培养基厌氧培养,培养后的样本离心分离上清和沉淀,-20℃以下冷冻保存。2.牛津杯抑菌试验通过优化待试菌的浓度、平皿倒入固体培养基浓度和体积、牛津杯的摆放、乳杆菌抑菌活性物质的加入体积、相互作用时间等优化牛津杯实验条件,建立本研究牛津杯抑菌试验的标准流程为后期抑菌实验奠定技术基础,具体流程如下:直径10cm的平皿中加入35ml 1.5%琼脂培养基,将敏感菌稀释到10~6CFU/ml涂布固体琼脂表面,完全吸收后,摆放牛津杯,每皿最多均匀摆放5个牛津杯,牛津杯内可最多加入230μl待检液体,存放4℃冰箱24h液体吸收完全后,转入37°C温箱孵育24h。取MRS培养基分离纯化的分离株的发酵液分别对大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca,K.oxytaca)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)进行牛津杯抑菌实验。3.乳杆菌的分离、鉴定、安全性分析和活性物质初探筛选出具有良好抑菌活性的发酵上清后,将其对应的菌泥转种至MRS琼脂培养基,间断划线接种后,置37℃厌氧培养72h,分离培养后挑取白色光滑可疑菌落,转至MRS液体培养基,置37℃厌氧培养。可疑菌落培养液涂片、干燥、固定、革兰染色后,置油镜下观察细菌的基本形态、排列及革兰染色特性。并进行过氧化氢酶试验、乳杆菌生化鉴定、16S r DNA测序等直接形态学、生化反应以及核酸检测鉴定细菌分离株,并命名。通过全基因组测序,溶血试验初步对细菌安全性进行评价。粗提有效抑菌蛋白纯化后送测序鉴定。并将含细菌素的培养上清进行牛津杯法抑菌活性检测,证明抑菌活性物质存在于培养上清。结果:1. 牛津杯抑菌试验流程优化牛津杯法测定抑菌活力,在国内外是通用的,前期我们采用传统的方法,发现抑菌试验实验结果不明显,如抗生素应该出现抑菌圈,但是结果却不清晰或没有抑菌圈出现,试验重复性差。我们通过多次试验敏感菌的浓度、平皿倒入固体培养基浓度和体积、牛津杯的摆放时机和方法、待检抑菌活性物质的加入体积、相互作用时间等与结果的比较,不断改进方法,力求实验结果更准确,重复性更好,将传统牛津杯试验进行了改良,优化后的流程见方法(2),改良后牛津杯法获得的不同待测细菌抑菌圈直径,较通用牛津杯法可重复性好,误差小。2. 牛津杯法筛选有拮抗致病菌作用的混合样本将100例健康育龄期女性阴道分泌物MRS培养基发酵培养后,离心分离菌泥和发酵上清,将上清分别对E.coli、K.oxytaca、S.aureus进行牛津杯抑菌实验。通过实验,筛出19个样本能拮抗致病菌,第47号样本菌能同时拮抗条件致病菌E.coli、K.oxytaca和致病菌S.aureus三种细菌。3. 有良好抑菌活性混合菌种中乳杆菌的分离与鉴定将第47号样本的菌泥在MRS琼脂平板上间断划线,置37℃恒温培养箱,厌氧培养72h,然后观察菌落,挑取中等大小白色光滑可疑菌落进行乳杆菌的增菌培养及鉴定。革兰染色结果可见革兰阳性短杆菌,散状排列。进一步生化鉴定,结果如下:过氧化氢酶试验阴性;单糖发酵试验结果提示可以分解纤维二糖、乳糖、菊糖、棉子糖、蔗糖、水杨苷、麦芽糖产酸。16S r DNA测序鉴定结果提示与Genebank已有的29株格氏乳杆菌亲缘关系较远,为格式乳杆菌新分离株。根据直接形态学观察、生化鉴定以及菌体成分核酸鉴定结果明确可疑菌落为格氏乳杆菌新分离株,并命名为格式乳杆菌(Lactobacillus gasseri,L.gasseri)HMV18。4.L.gasseri HMV18的安全性分析与有效抑菌成分的初探L.gasseri HMV18通过全基因组测序,显示其基因组包括1.95Mb染色体,4.6kb小质粒、32kb大质粒和3.9kb噬菌体。基因预测结果显示,该菌质粒或噬菌体上没有编码耐抗生素的基因,说明该菌不具有水平转移耐药性的威胁。全基因组测序结果显示,其染色体上携带gat AX基因,编码格氏乳杆菌素Gassericin T(Gat AX)。将L.gasseri HMV18的培养上清和粗提产物分别经SDS-PAGE,染色后进行分子量鉴定。粗提蛋白纯化后送测序鉴定。并将含Gassericin T培养的上清进行抑菌活性检测,证明抑菌活性物质为L.gasseri HMV18的外泌蛋白,存在于L.gasseri HMV18的厌氧发酵上清中。溶血试验结果提示L.gasseri HMV18菌落周围可见α溶血环。结论:1.改良后的牛津杯抑菌试验流程能够保证抑菌实验的精准性,可重复性,适合用于临床样本的大量筛选。2.育龄妇女的阴道分泌物中能分离纯化出格式乳杆菌,且有拮抗致病菌的作用,本研究纯化出一株格式乳杆菌新新分离株HMV18,并证明可以拮抗条件致病菌或致病菌E.coli、K.oxytaca、S.aureus的生长繁殖。3.L.gasseri HMV18新分离株传统表型试验与基因组学结果均证实该菌无毒力基因,不具有水平转移耐药性的威胁,可以产生细菌素Gassericin T,对阴道致病菌有拮抗作用。4. HMV18可产生α溶血,对月经后阴道有自净作用。