【目的】目前绝大部分避孕方法均应用于女性,且存在一定的不良反应及副作用,因此,研究和发展男性避孕方法具有重要意义。精子头部发生顶体反应释放的顶体酶协助精子穿越透明带是人类受精过程中必不可少的步骤之一,故抑制精子顶体酶可阻断受精过程。以顶体酶为靶点,第二军医大学药学院药物化学教研室吕加国教授等采用同源模建方法构建人精子顶体酶的三维结构模型,利用InsightII/Bindingsite方法准确定位人精子顶体酶的活性位点,通过柔性分子对接技术建立并合成了一系列顶体酶抑制剂。本课题意在建立顶体酶抑酶活性筛选模型,通过残余精子顶体酶活性检测、体外试验及动物体内实验,研究精子顶体酶抑制剂抑制顶体酶的能力及对精子形态及功能的影响,为开发男性避孕药、研究受精机制提供依据。【研究方法】本研究包括以下3部分:1.精子顶体酶抑制剂筛选模型的建立:通过改良Kennedy法,以BAPNA为底物,顶体酶水解其酰胺键,生成发光基团,酶标仪能检测此基团的吸光度,从而计算顶体酶活性,以此原理建立顶体酶抑制剂筛选模型。对68种化合物进行筛选,以期筛出2种活性较强的化合物。阳性对照组使用经典顶体酶抑制剂TLCK和KF-950。2.对精子超微结构和精子—半透明带结合试验的影响:配制不同浓度梯度的顶体酶抑制剂分别与精子作用,电镜下观察精子超微结构变化。选用试管婴儿实验室中,因男性因素受精失败的卵细胞和健康可生育男性的精子作为研究对象。在解剖显微镜下将卵细胞透明带剥离,并平分为两部分。与经顶体酶抑制剂作用后的精子置于二氧化碳培养箱孵育4h,显微镜下观察粘附透明带的精子数量。3.大鼠体内实验:以SD年轻雄性大鼠(6～8w龄,体重200～250g)为研究对象,将不同浓度梯度的精子顶体酶抑制剂配成悬浮液,灌胃大鼠,每7d称重1次。灌胃7w后解剖雄鼠,检测其精子顶体酶活性及血清FSH、LH、T水平。同时取其睾丸、附睾及前列腺称重,计算其脏器系数。【结果】1.精子顶体酶抑制剂筛选模型的建立:通过改良Kennedy法,以BAPNA为底物建立了顶体酶抑制剂筛选模型,由68种化合物中筛选出2种抑酶活性强,性质稳定的化合物4M-2434和GS-0122。残余精子顶体酶活性与顶体酶抑制剂浓度呈负相关;4M-2434浓度为0.9μmol/mL时,7.5×10~6个精子的顶体酶被完全抑制;GS-0122浓度为2μmol/mL时,7.5×10~6个精子的顶体酶被完全抑制。其抑制精子项体酶的能力比经典顶体酶抑制剂TLCK分别高约400倍和200倍。2.对精子超微结构和精子—半透明带结合试验的影响:电镜下精子超微结构随顶体酶抑制剂浓度增加,其异常程度增加,尤其以顶体部分为明显;精子—半透明带结合试验表明,精子穿透透明带的能力与精子顶体酶抑制剂的浓度呈负相关。项体酶抑制剂4M-2434浓度为0.9μmol/mL,GS-0122浓度为2μmol/mL时,精子穿透明带数为0。与活性实验结果符合。3.大鼠体内实验:灌胃过程中,4M-24343个浓度组大鼠体重增加幅度小于GS-01223个浓度组(P＜0.05)。灌胃5w后检测顶体酶活性,两种化合物各浓度组大鼠精子顶体酶活性与药物浓度呈负相关。灌胃5w、7w后分别检测雄鼠血清中FSH、LH和T,与对照组无明显差异(P＞0.05)。实验组大鼠性器官未见明显改变。【结论】1.精子顶体酶抑制剂筛选模型的建立:通过改良Kennedy法,依据BAPNA与胰蛋白酶类的反应原理,可建立顶体酶抑制剂活性筛选模型。以此为基础筛选出的2种精子顶体酶抑制剂2,4-二氯苯基咪唑基-3,4-二氯醇醚(4M-2434)和胍基取代杂环噻唑磺酰胺(GS-0122),抑酶活性比经典项体酶抑制剂TLCK分别强约400倍和200倍。2.对精子超微结构和精子—半透明带结合试验的影响:精子顶体酶抑制剂对精子形态尤其是顶体部分的超微结构有破坏作用,而对精子尾部影响不明显。其能够高效抑制精子顶体酶活性,阻止精子和透明带的结合。3.大鼠体内实验:4M-2434和GS-0122两种化合物动物实验表明,口服精子顶体酶抑制剂,可抑制雄性大鼠体内精子顶体酶活性,对大鼠内生殖器及性激素无明显影响。本实验验证了计算机辅助设计合成的精子项体酶抑制剂的高效性和可靠性。所成功筛选出的4M-2434及GS-0122两种化合物能够高效抑制精子顶体酶活性,阻断受精过程,具备开发成避孕药的前景。