论文部分内容阅读
目的:制备一种新型载光声、光热材料黑色素（Melanin）,化疗药物紫杉醇（PTX）以及相变材料全氟丙烷（perfluoropentane,PFP）的多功能诊疗纳米粒（PTX-MEL-PFP-NPs）,检测其光学、超声、光热效应以及生物安全性;观察PTX-MEL-PFP-NPs在体外增强超声、光声成像的效果,探讨其作为双模态造影剂的可行性;观察PTX-MEL-PFP-NPs在体外药物控释性能及光热联合化疗M DA-MB-231细胞的效果,探讨其作为多功能诊疗纳米粒的应用前景。方法:通过两步乳化法及磁力搅拌蒸发法制备PTX-ME L-PFP-NPs;使用光学显微镜、透射电镜、扫描电镜、紫外分光光度计等检测纳米粒的表面结构、形态、电位分布、平均粒径、包封率、载药量以及紫外吸光光谱等;PTX-MEL-PFP-NPs光致升温性能检测:将纳米粒分为0.2、0.4、0.8、1.6 mg/ml浓度组和0.5 W/cm~2、1.0 W/cm~2、1.5W/cm~2激光能量组,分别经激光仪辐照180s,智能热成像仪检测其升温特性;光热稳定性检测:利用同一能量激光辐照PTX-MEL-PFP-NPs四个循环,检测其升温稳定性能。体外超声成像:分为PTX-MEL-PFP-NPs组、PTX-PFP-NPs组和双蒸水组,每组经激光辐照10min,用超声诊断采集辐照前后的基波及谐波模式图像,观察其增强超声成像效果;体外光声成像:分为PTX-MEL-PFP-NPs、PTX-PFP-NPs及双蒸水组,采用光声成像仪进行光声信号采集,再将PTX-MEL-PFP-NPs组按Melanin含量0ug/ml、200ug/ml、400ug/ml、800u g/ml、1600ug/ml分为5组进行光声信号采集,并绘制浓度-光声强度曲线图。药物控释性能检测:将PTX-MEL-PFP-NPs分为激光辐照组与无激光辐照组,利用高效液相色谱法比较两组纳米颗粒中紫杉醇的时间累积释放差异;细胞吞噬实验:制备经Di I标记的PTX-MEL-PFP-NPs,将其与MDA-MB-231分别孵育1h,3h和5h,通过激光共聚焦显微镜观察不同时间内细胞对纳米粒的吞噬能力;生物安全性检测:将MDA-MB-231细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）分别与不同浓度（0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.8 mg/ml、1.6 mg/ml、3.2 mg/ml、6.4mg/ml）纳米颗粒共同孵育24h,通过CCK8法检测纳米粒对两种细胞的毒副作用;PTX-MEL-PFP-NPs体外抗肿瘤效果检测:将含不同PTX浓度的纳米颗粒分为PTX组,PTX-MEL-NPs组,PTX-ME L-PFP-NPs组,PTX-MEL-NPs+NIR组,PTX-MEL-PFP-NPs+NI R组与MDA-MB-231细胞分别孵育24h,利用CCK8法及流式细胞技术检测细胞活性及凋亡率。结果:成功制备PTX-MEL-PF P-NPs,其呈单个球型,分散性好,平均粒径为（290.5±35.4）n m,Zeta电位为（-10.5±6.8）Mv。透射电镜下可见大量黑色素颗粒较均匀分布于纳米粒中。测得纳米粒PTX包封率为（69.98±5.67）%,载药量为（6.65±3.67）%。经高效液相色谱法测得纳米粒经激光辐照后2d内的紫杉醇累积释放量为（53.15±4.2）%,是无激光辐照组的2倍。光热实验显示,随着纳米颗粒浓度的提高及激光能量的增强,PTX-MEL-PFP-NPs的光热转换效率越来越高。体外超声成像显示,经激光辐照后,PTX-MEL-PFP-NPs可发生液-气相变转变为微泡,回声强度较辐照前明显增强（P<0.05）;体外光声成像实验显示,PTX-MEL-PFP-NPs可检测到明显的光声信号,且光声信号的强度随纳米粒浓度的提高而增强。体外细胞吞噬结果:PTX-MEL-PFP-NPs与MDA-MB-231共同孵育5h后,镜下可见大量红染纳米粒被细胞吞噬入胞质中。体外CCK8实验结果示,MEL-PFP-NPs在0到6.4mg/m L范围内细胞活性差异无统计学意义（P>0.05）,说明材料PLGA、黑色素以及PFP无明显毒副作用,有很好的生物安全性和生物相容性;在体外抗肿瘤实验中,PTX-MEL-PFP-NPs+NIR组经激光辐照后,MDA-MB-231细胞活性最低,凋亡率最高,与PTX、PTX-MEL-NPs,PTX-MEL-NPs+NIR和PTX-MEL-PFP-NPs四组比较细胞活性和凋亡率差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:成功制备PTX-MEL-PFP-NPs,其分布均匀,包封率、光热转化效率及生物安全性高。PTX-ME L-PFP-NPs在体外可用作增强光声、超声双模态显像,能够响应激光的辐照,加快药物释放,并且在体外PTX-MEL-PFP-NPs能够实现光热协同化疗抗MDA-MB-231细胞的效果,为下一步体内多模态成像、光热治疗、药物控释以及增效HIFU奠定实验室基础。