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Notch信号途径是在发育过程中通过介导细胞间的相互作用而调控细胞分化方向的重要信号途径，在进化中高度保守。在果蝇胚胎发生早期，通过对Notch受体及其相关分子进行的大量丧失功能突变的研究证实，Notch信号调节果蝇多种组织在不同阶段的分化。在小鼠，突变Notch受体及其下游关键转录因子RBP-J(Recombination signal binding protein-Jκ)均可导致小鼠胚胎早期死亡，同时伴有中胚层的体节发育障碍，神经管不能闭合等现象，说明Notch受体是在胚胎发育中调节前体细胞分化方向的关键分子。最近，韩骅与其他研究者的研究结果都表明，在成年小鼠条件性剔除Notchl或其下游转录因子RBP-J可引起T淋巴细胞和B淋巴细胞分化方向的改变，说明Notch／RBP-J信号途径在成年个体中也是细胞分化的主要调节因素之一。因此，深入研究Notch信号途径的功能及其作用机理，对于理解胚胎发育、干细胞分化及相关疾病的发生都具有重要的理论和实践意义。 Notch为Ⅰ型单次跨膜受体，其配体Delta家族分子也是跨膜蛋白。当相邻细胞间的Notch受体和配体相互作用后，由蛋白酶催化在Notch受体的跨膜区发生蛋白裂解，使Notch胞内区(Notch intracelluar domain，NIC)从细胞膜内侧释放并进入核内。进入核内的NIC可通过RAM(RBP-J association molecule)结构域与转录因子RBP-J相互作用，激活含有RBP-J识别位点的启动子的转录，从而调节细胞分化相关基因的表达。所以转录因子RBP-J是Notch受体在核内的主要效应分子。另外，除了NIC外，第四军医人学博]:学位论文RBP一J还介导EB病毒核抗原EBNAZ(Epstein一Barr nuelear antigenZ)的转录激活作用。 然而，当不存在转录激活物时，RBP一J则介导转录抑制作用。在哺乳动物细胞中，多种RBP一J相互作用蛋白，如组蛋白脱乙酞化酶(Histonedeaeetylase，HDAC)和核基质蛋白M创T(MSxZ一interaeting nuelear targetProtein)都可抑制NIC或EBNAZ激活的RBP一J介导的转录。但是，RBP一J介导的转录抑制作用的机理仍不清楚。 KyoTZ是一种与RBP一J相互作用的LIM结构域蛋白，可通过竞争RBP一J上的结合位点抑制NIC或EBNAZ对RBP一J介导的转录的激活作用。但是，大量文献报道证实LIM结构域是一种蛋白质相互作用界面。因此，我们提出:KyoTZ在通过其RBP一J结合位点竞争性抑制NIC和EBNAZ的转录激活作用外，还可能通过其LIM结构域向RBP一J募集其它转录调控分子。 为了证实这一观点，本研究在以往工作的基础上，深入研究了KyoTZ与peG(polyeomb group)复合物蛋白RINGI和HpCZ以及KyorZ与KBPI(KyoTZ一binding proteinl)之间的物理和功能相互作用，以及这种相互作用对RBP一J介导的转录激活的影响。主要研究结果包括:1.RINGI通过LIM蛋白KyoTZ抑制NIC激活的RBP一J介导的转录。 首先通过酵母双杂交证实RINGI与KyoTZ之间存在相互作用，并初步确定了它们之间相互作用的位点。即R州Gl的C端负责和KyoTZ的LIM结构域相互作用，而RINGI的N端不能与KyoTZ的LIM结构域相互作用;其次，体外GST-pull down和体内免疫共沉淀(CO一inUnunoprecipitation，eo一Ip)及哺乳动物细胞内双杂交分析进一步证实R俐Gl和KyoTZ之间存在物理相互作用。同时，体内co一工P证实RINGI和RBP一J虽不能直接地相互作用，但两分子可同时被KyoTZ通过其LIM结构域和C端的RBP一J结合基序共沉淀下来。提示:KyoTZ可与RINGI和RBP一J在细胞内共同形成三分子复合物;之后，利用报告基因实验排除了细胞内RINGI对基本启动子具有广泛的抑制活性后，转录活性分析实验证实，过表达RINGI和KyoTZ不仅可抑制NIC激活的RBP一J介导的转第四军医大学博士学位论文录，亦可抑制构成性活化的RBP一J一vP16的转录激活。提示:KyoTZ可能通过募集R困Gl参与RBP一J介导的转录抑制。最后，同样通过转录活性分析实验发现，在细胞内过表达Ky0TZ结合蛋白KBPI，可拮抗RINGI对RBP一J介导的转录的抑制效应，同时结合KBPI与RINGI竞争性结合KyoTZ LIM结构域的事实，进一步证实R则Gl抑制RBP一J介导的转录是依赖于与KyoTZ的结合。2.HPcZ与 LIM蛋白勺oTZ相结合抑制Nlc激活的RBP一J介导的转录。 首先通过酵母双杂交证实HPcZ与KyoTZ之间存在相互作用，并初步确定了它们之间相互作用的位点。即HPCZ的c端主要负责和KyoTZ的UM结构域相互作用，而N端与KyoTZ的LIM结构域的相互作用较弱;其次，体外GST-Pull down和体内co一IP及哺乳动物细胞内双杂交分析进一步证实HPcZ和KyoTZ之间存在物理相互作用。同时，体内co一IP也证实KyoTZ与HPCZ和RBP一J之间能形成三分子复合物;最后，我们通过一系列报告基因实验证实，过表达HPcZ和KyoTZ不仅可抑制RBP一J介导的NIC的转录激活作用，亦可抑制构成性活化的RBP一J一VP16的转录激活。过表达HPcZ一KyoTZ或R州Gl一KyoTZ的融合蛋白强烈地抑制RBP小VP16的转录激活。在细胞内共表达HPCZ、RINGI、Ky0TZ三分子复合物，发现三者组成的抑制复合物能强烈地抑制NIC激活的RBP一J介导的转录。提示:KyoTZ可以通过募集犯NGI和HPCZ抑制复合物参与RBP一J介导的转录抑制。3.KBPI?