【摘 要】
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应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术来研究黄化突变体差异表达的基因，成功构建了甘蓝型油菜幼叶黄化突变体Cr3529和野生型3529的正、反向消减文库。通过菌落PCR和斑点杂交，对正向消减文库进行差异筛选，共筛选到125个野生型3529差异表达的cDNA片段，其大小在100 bp到1000 bp之间。随机挑取38个阳性克隆测序，
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应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术来研究黄化突变体差异表达的基因，成功构建了甘蓝型油菜幼叶黄化突变体Cr3529和野生型3529的正、反向消减文库。通过菌落PCR和斑点杂交，对正向消减文库进行差异筛选，共筛选到125个野生型3529差异表达的cDNA片段，其大小在100 bp到1000 bp之间。随机挑取38个阳性克隆测序，测序结果与GenBank数据库进行分析比较，发现除两个序列外，其它均为非重复出现的序列，其中四个克隆可能为新的基因序列，其余的克隆涉及到蛋白质代谢、糖代谢、光合作用、能量代谢、胁迫反应以及激素作用等多个代谢途径，这些基因片段在抑制性消减杂交前后的表达量有较大变化，即消减后被大大富集了。 为了探究黄化性状的突变机理，提取甘蓝型油菜黄化突变体Cr3529的总RNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增并克隆得到与拟南芥叶绿体外膜转运机器构件蛋白基因Toc33同源的cDNA编码区序列，命名为BnToc33-c，测序结果显示这段cDNA的长度为894 bp，与拟南芥Toc33 cDNA有着较高的同源性。突变油菜Cr3529与野生型3529在Toc33的基因序列上有3处碱基存在着差异，均为错义突变，它们所编码的氨基酸都相应地发生了变化，其中一处位于TOC33蛋白的跨膜区域内，推测Cr3529中TOC33蛋白C-端跨膜区域内的差异可能影响该蛋白向叶绿体外被膜的锚定，降低TOC33的插入效率，也可能 四川大学硕士学位论文 影响此蛋白本身所具有的GTP酶的性质，导致仆卜绿体外被膜上蛋白转运过程 的中断，造成转运障碍，推测这一变化可能与幼汗卜黄化突变相关。 关键词:抑制消减杂交;差异筛选;差异表达基因;Rl’- PCR:蛋白转运
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