【摘 要】
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目的:糖尿病肾病（DN）,是糖尿病患者中常见的一种严重而且结局不理想的并发症。其发病机制复杂,主要机制表现为肾脏在高糖的作用下,因受到氧自由基的攻击而遭受损害。现临床上并没有针对其治疗的特效药,病人最终发展为尿毒症而死亡。肌肽是一种在人体中天然存在的二肽,具有抗氧自由基的特性,对DN的治疗存在潜在的价值。本实验拟探人肾小管上皮细胞即HK2细胞被氧化损伤时发生凋亡的潜在机制及肌肽对其可能的保护作用,
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目的:糖尿病肾病（DN）,是糖尿病患者中常见的一种严重而且结局不理想的并发症。其发病机制复杂,主要机制表现为肾脏在高糖的作用下,因受到氧自由基的攻击而遭受损害。现临床上并没有针对其治疗的特效药,病人最终发展为尿毒症而死亡。肌肽是一种在人体中天然存在的二肽,具有抗氧自由基的特性,对DN的治疗存在潜在的价值。本实验拟探人肾小管上皮细胞即HK2细胞被氧化损伤时发生凋亡的潜在机制及肌肽对其可能的保护作用,以期为糖尿病肾病的治疗提供新的思路。方法:使用肌肽干预被过氧化氢(H2O2)损伤的HK2细胞,分4组:对照组、H2O2（200μM）组、肌肽组以及H2O2+肌肽组,培养24小时后进行后续实验。用H2O2处理HK2细胞后,用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况及肌肽对H2O2细胞毒性作用的影响;使用ROS试剂盒检测肌肽和H2O2对HK2细胞活性氧（ROS）水平的影响;使用SOD试剂盒检测肌肽和H2O2对HK2细胞总超氧化物歧化酶（SOD）水平的影响;蛋白免疫印迹（Western blot）法测量HK2细胞中KIM-1,IL-1β,NADPH氧化酶亚基NOX2、NOX4以及凋亡蛋白的表达量;使用激光共聚焦倒置荧光显微镜观察H2O2和肌肽对HK2细胞线粒体膜电位以及对HK2细胞中细胞色素C（Cyt C）相对位置的影响。结果:（1）CCK-8实验结果显示HK2细胞的增殖能力在浓度为100、200、300、400μM的H2O2作用下被强烈抑制（P<0.01）,且实验观测到最适宜抑制浓度为200μM。与H2O2组相比,在HK2细胞中分别加入40、50、60、70 m M的肌肽后,HK2细胞增殖能力较H2O2组增高（P<0.05）,且实验观察到当肌肽浓度为60 m M时,HK2细胞增殖能力最强。（2）与对照组相比,H2O2组中HK2细胞内ROS水平升高（P<0.01）,而与H2O2组相比,H2O2+肌肽组中HK2细胞内ROS水平降低（P<0.001）,肌肽组与对照组相比没有发生显著变化。（3）与对照组相比,H2O2组中HK2细胞内SOD活性降低（P<0.001）,而与H2O2组相比,H2O2+肌肽组中HK2细胞内SOD活性升高（P<0.001）,肌肽组与对照组相比没有发生显著变化。（4）Western blot显示:与对照组相比,H2O2组HK2细胞中KIM-1、IL-1β、NOX4、BAX、caspase 3表达升高（P<0.05）,BCL-2表达减少（P<0.001）;而与H2O2组相比,H2O2+肌肽组HK2细胞中KIM-1、IL-1β、NOX4、BAX、caspase3表达减少（P<0.05）,BCL-2表达增多（P<0.001）。H2O2和肌肽对NOX2的表达没有显著的影响（P>0.05）。（5）用激光共聚焦倒置荧光显微镜观察到:与对照组相比,H2O2组HK2细胞的线粒体膜电位降低,发出绿色的荧光,而与H2O2组相比,H2O2+肌肽组HK2细胞的线粒体膜电位较高,发出红色的荧光;与对照组相比,H2O2组HK2细胞中Cyt C从线粒体基质转入胞质中,荧光为绿色的Cyt C与荧光为红色的线粒体重合减少,而与H2O2组相比,H2O2+肌肽组HK2细胞中Cyt C较少从线粒体基质转入胞质中,荧光为绿色的Cyt C与荧光为红色的线粒体重合较多。结论:肌肽能够抑制NOX4、BAX、caspase 3的表达,提高SOD的活性以及BCL-2的表达,从而抑制HK2细胞内ROS的产生,缓解HK2细胞的氧化应激,最终抑制HK2细胞线粒体途径凋亡。这些发现表明肌肽可以减轻线粒体氧化应激,保护线粒体功能,抑制HK2细胞凋亡。
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