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血管性痴呆(VD)是仅次于阿尔采默病(AD)引起老年期痴呆的常见病因,严重危害老年人生存质量,但迄今还没有治疗vD的有效方法。VD大多由于脑血流量明显减低导致的脑灌注不足所致,对缺血缺氧非常敏感的海马在VD的认知功能障碍的发生发展中起重要作用。由于大量研究证实成年脑内存在具有增殖与分化潜能的神经干细胞(NSCs),比如海马齿回(DG)和室下区(SVZ)等,尤其是海马NSCs的增殖、分化、迁移和整合因与学习记忆过程密切相关,给治疗VD带来了新的希望。近来研究发现,脑缺血可以激活脑内NSCs增殖、迁移和分化,但是脑缺血后增强的神经发生并不能代偿因缺血而造成的神经元丢失和海马的学习记忆功障碍,所以目前创造合适的微环境,进一步激活自身的NSCs和内源性修复已成为一个重要的研究方向。在这一方面,5-HT和选择性中枢5-HT再摄取抑制剂(SSRIs)类药物倍受关注。此外研究发现,5-HT1A受体不仅在海马含量丰富,而且是5-HT介导神经发生的主要受体。尽管如此,目前仍缺乏有关SSRIs对脑缺血神经发生及认知障碍作用及作用机制的研究。
基于上述理由,我们假设:SSRIs类药物西酞普兰(CIT)可促进VD大鼠脑内NSCs增殖及分化,并进而改善大鼠认知功能,而且此过程受到5-HT1A受体功能的调控。本研究可为脑缺血海马神经发生的调控提供重要的实验依据,也可为临床干预脑缺血性认知功能障碍提供新的思路。
研究目标:
1.阐明VD大鼠脑内神经干细胞增殖的时空关系;
2.明确CIT对脑内不同部位NSCs增殖和分化的作用及其对大鼠认知功能的影响;
3.初步阐明CIT促脑缺血神经发生及影响认知功能的机制:5-HT及5-HT1A受体的作用探讨。
研究方法:
1.动物分组及处置:Wistar大鼠(n=336)随机分为正常正常对照组(NC)、假手术对照组(SC)、血管性痴呆组(VD)、西酞普兰干预的血管性痴呆组(VD-C)以及西酞普兰和WAY100635联合干预组(VD-CW),后四组按手术后时相点每组分术后1、3、7、14、21、42d组。CIT20mg/kg、WAY1006350.3mg/kg腹腔注射,1次/d,21天后造模,造模后持续给药至相应时相点。BrdU50mg/kg腹腔注射,每天1次,第7次注射后12h处死动物用于NSCs增殖的研究;对各实验组术后14d亚组,每天1次,第7次注射后28d处死大鼠用于NSCs分化的研究。采用改良的Pulsinelli’s四血管阻断法制作VD动物模型
2.动物认知功能检测:Morris水迷宫定位航行实验和空间搜索实验检测平均逃逸潜伏期(EL)、平台象限游泳距离百分比(DP)和穿越平台次数反映大鼠空间学习和记忆功能;大鼠电生理检测类P3波潜伏期(类P3L)。
3.NSCs增殖的观察:采用免疫组织化学方法,35μm新鲜冰冻切片0.3%TritonX-100和2NHCl处理后,SABC法Cy3免疫荧光或DAB显色后,显微镜下观察拍照。
4.NSCs分化的观察:采用:BrdU免疫荧光双标记的方法,BrdU免疫荧光标记后,分别加GFAP或Tui-1或Calbindin-D28k抗体,各自标记星形胶质细胞、幼稚和成熟神经元及成熟神经元,另一荧光显色系统显色后,倒置荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察拍照。
5.尼氏染色检测海马CA1神经元存活情况。
6.5-HT1A受体表达测定:采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法,上游引物5’-GCCCCCCAAGAAGAGCCTGA-3’,下游引物5’-GCCATCTTGCGCTTTGCTTC-3’。内参照物GAPDH上游引物:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’,下游引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。先后进行总RNA提取,逆转录反应及实时荧光定量PCR扩增。以相对表达丰度反映5-HT1A受体mRNA表达。
7.高效液相色谱(HPLC)检测海马和皮层神经递质的含量。
8.细胞计数及统计学处理:形态学研究组织切片均在同一放大倍数下分析(免疫组织和免疫荧光化学200×,组织化学400×),应用IPP6.0图像分析软件进行分析。所有数据资料均以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS11.0统计软件进行分析。
研究结论:
1.全脑缺血再灌注可诱导成年大鼠脑内神经发生增强,以海马DG和SVZ区新生神经细胞的增殖最明显,海马CA1、CA2区和PCg皮层也发现脑缺血后神经发生增强的现象。海马和皮层增强的神经发生在术后14d达高峰,21d开始下降,一直可持续到术后42d;而SVZ神经发生的高峰出现在术后7d。大鼠脑缺血再灌注后水迷宫和类P3认知功能的改变,与海马及皮层BrdU阳性细胞的增殖没有相关性。
2.CIT可显著促进VD大鼠海马DG、CA1、CA2区和皮层的BrdU阳性细胞增殖,对SVZ区的新生神经细胞增殖无明显影响。同时,CIT可显著促进海马DG、CA1区和皮层新生神经细胞的成神经元分化,并且该作用与CIT改善VD大鼠认知障碍的效应关系密切。CIT的上述作用可被联合应用WAY100635所逆转。
3.CIT促进VD大鼠脑内神经发生的机制,可能与其提高中枢突触间隙5-HT水平、增加海马5-HT1A受体mRNA表达有关;而其改善动物认知障碍的作用,在术后21d内可能与其调节海马及皮层单胺类神经递质水平、保护海马CA1区神经元有关,在术后42d则可能是通过促进海马和皮层新生神经细胞的成神经元分化及神经保护作用实现的。