研究背景：多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是无排卵性不孕的常见原因，发生于5%-10%的育龄期妇女。迄今为止，多囊卵巢综合征的病因学和发病学尚不明确。多囊卵巢综合征的家族聚集现象提示遗传因素在其发病机制中起重要作用。大多数PCOS患者有高雄激素血症的临床和生物化学证据。目前所公布的PCOS诊断标准，均将高雄激素血症作为诊断特征之一。在前期研究工作中，我们通过基因芯片发现SET在多囊卵巢综合征患者卵巢中表达上升。卵泡膜-间质细胞生成雄激素亢进是PCOS高雄激素血症的重要原因。SET蛋白能与大鼠CYP17基因特异的DNA序列结合而活化其转录，推测SET可以通过调节雄激素合成酶的表达而影响雄激素合成；PCOS卵巢高表达SET蛋白，与PCOS高雄激素密切相关。研究目的：在小鼠窦前卵泡体外培养模型、体外培养小鼠卵泡膜--间质细胞模型上，观察SET蛋白对小鼠窦前卵泡睾酮合成的影响；再拟构建SET转基因小鼠模型，观察小鼠的表型以及生殖系统的变化。这些实验，将阐述SET通过调节雄激素合成酶而影响雄激素合成，而SET高表达可能是PCOS高雄激素病理生理机制之一。材料与方法：1.利用小鼠窦前卵泡体外培养模型，将构建的重组腺病毒AdCMV-SET和AdsiRNA-SET分别感染小鼠卵泡膜细胞，研究SET蛋白对小鼠窦卵泡睾酮合成的影响。Western blot验证SET的超表达及干涉效果，放免法（radio immunoassay，RIA）检测卵泡培养液中睾酮浓度。qPCR检测在卵泡膜细胞中超表达及干涉SET后对雄激素合成酶（StAR、CYP11A1、HSD3B2、CYP17A1）mRNA水平的影响。2.体外培养小鼠卵泡膜-间质细胞，在单一细胞体系下研究膜细胞雄激素合成，通过SET超表达及干涉研究SET对小鼠卵泡膜-间质细胞睾酮合成的影响。Western blot验证SET的超表达及干涉效果，放免法（RIA）检测膜细胞培养液中睾酮浓度。qPCR检测SET在膜细胞中超表达及干涉后对雄激素合成相关限速酶（StAR、CYP11A1、HSD3B2、CYP17A1）mRNA水平的影响。3.由于SET蛋白在体内广泛表达，我们希望能够构建卵巢尤其是膜细胞特异性超表达SET的转基因小鼠。若两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向一致，cre重组酶能有效切除两个loxP位点间的序列，实现基因剔除的目的。因此我们构建了含有loxp-stop-loxp位点SET质粒。Ren等人用卵巢特异性表达的Amhr2-cre工具鼠与loxp-stop-loxp-SmoM2小鼠交配后获得的双阳性小鼠中SmoM2在颗粒细胞及膜细胞中均有超表达[33]。因此我们选用了Amhr2-cre工具鼠与loxp-stop-loxp-SET小鼠交配，其形成的双阳性小鼠卵巢表达cre酶，可切除SET基因上游的stop位点，实现SET超表达。同时我们也选用全身性表达的EⅡa-cre工具鼠与loxp-stop-loxp-SET小鼠交配，使SET全身性超表达，在体研究SET在基因组、转录组、蛋白质组和代谢组水平的功能及作用。（1）SET条件转基因小鼠构建：构建转基因质粒SETloxStop/+，转基因质粒显微注射法导入小鼠受精卵，获得F0代SET条件转基因小鼠。出生5天后的幼鼠，剪尾巴提取基因组DNA，PCR检测其基因型，SET基因整合的小鼠为F1代。同时从mRNA水平检测SET基因的转录；（2）全身性表达cre重组酶转基因小鼠EⅡa-cre及卵巢组织特异性表达cre重组酶转基因小鼠Amhr2cre/+分别与SET条件基因打靶小鼠SETloxStop/+交配，获得全身性高表达SET基因转基因小鼠模型SETlox/+；EⅡacre/+及卵巢组织特异性高表达SET基因转基因小鼠模型SETlox/+；Amhr2cre/+。出生5天后的幼鼠，剪尾巴提取基因组DNA，PCR检测其基因型，SET基因和cre基因同时整合的小鼠为F2代。活体成像观察F2代小鼠体内红色荧光蛋白mCherry的表达；（3）观察转基因小鼠SETlox/+；Amhr2cre/+与PCOS表型相关指标：Western blot验证SET在卵巢、子宫、输卵管、肝脏、脑等组织的超表达效果，组织学观察相应形态变化，放免法（RIA）检测血液中睾酮浓度、检测血糖和血脂等代谢指标。目前这部分工作正在进行中。结果：1.重组腺病毒AdCMV-SET感染小鼠卵泡膜细胞后，SET蛋白超表达（p<0.05），培养液中睾酮合成增加（p<0.05），SET、CYP17A1、HSD3B2在转录水平的表达升高（p<0.05），而StAR、CYP11A1mRNA无显著改。2.重组腺病毒AdsiRNA-SET感染小鼠卵泡膜细胞后，SET蛋白表达抑制（p<0.05），培养液中睾酮合成减少（p<0.05），SET、CYP17A1、HSD3B2在转录水平的表达下降（p<0.05），而StAR、CYP11A1mRNA水平无显著改变。3.重组腺病毒AdCMV-SET感染小鼠卵泡膜-间质细胞后SET超表达，但睾酮浓度无差异(p>0.05)，雄激素生成酶CYP17A1、HSD3B2、StAR、CYP11A1在mRNA水平无显著改变(p>0.05)。4.重组腺病毒染小鼠卵泡膜-间质细胞后SET表达抑制，但睾酮浓度无差异(p>0.05)，雄激素生成酶CYP17A1、HSD3B2、StAR、CYP11A1在mRNA水平无显著改变(p>0.05)。5.提取转基因小鼠的基因组，PCR检测发现较对照组SET超表达约150倍，IVIS Spectrum小动物活体可见光成像系统观察结果显示，转基因小鼠体内红色荧光蛋白mCherry表达，说明SET基因已成功转入。F2代的荧光弱于F1代，说明cre重组酶与loxP发生重组，获得全身性SET转基因小鼠模型SETlox/+；EⅡacre/+。结论：1.在小鼠卵泡中，SET通过正向调节雄激素合成限速酶CYP17A1、HSD3B2的表达，促进雄激素合成。SET在PCOS卵巢中的表达上升可能通过促进雄激素合成限速酶CYP17A1、HSD3B2的表达促进雄激素合成，进而促进PCOS高雄激素血症的形成。2.SET在小鼠卵泡膜-间质细胞对雄激素合成限速酶StAR、CYP11A1、HSD3B2、CYP17A1mRNA水平无影响，对睾酮的合成也不产生影响。SET对小鼠卵泡膜-间质细雄激素合成的影响可能需要颗粒细胞、卵母细胞等的共同参与调节。3.SET转基因小鼠的mRNA表达水平较野生型小鼠显著上升约150倍，可见光成像系统观察发现cre/loxP启动，SET蛋白超表达。说明成功构建SET超表达转基因小鼠模型，并繁育出全身性SET超表达的F2代小鼠。