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目的探究长链非编码RNA Gas5通过竞争性结合miRNAs,调节其自噬靶基因的表达,明确lncRNA Gas5调控RAW264.7细胞自噬的分子机制。方法利用3-甲基腺嘌呤(3-MA)和饥饿(Stravation)条件分别处理细胞建立细胞自噬抑制和细胞自噬模型,实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测各处理组中lncRNA Gas5的表达量;构建lncRNA Gas5过表达与敲除细胞模型,通过western blot、激光共聚焦和透射电镜分别检测自噬标志蛋白LC3和自噬小体的形成与数量的变化情况,发现lncRNA Gas5对RAW264.7细胞自噬的调控影响;生物信息学分析预测lncRNA Gas5靶向的mi RNAs及其自噬相关靶基因,确定miR-181c-5p及其靶基因Atg5作为研究对象;分别构建Gas5-wt/mut和Atg5 3’UTR-wt/mut重组报告载体,通过检测荧光素酶活性的变化并结合qRT-PCR检测来验证miR-181c-5p对lncRNA Gas5及Atg5的靶向调控作用;通过qRT-PCR检测lncRNA Gas5过表达与敲除后对miR-181c-5p和Atg5基因表达量的影响,同时利用western blot检测上述处理后Atg5蛋白水平的变化,研究lncRNA Gas5对自噬关键蛋白Atg5的影响;对lncRNA Gas5进行过表达(Gas5)与敲除(sh-Gas5),并将miR-181c-5p mimics/inhibitors共转染至RAW264.7细胞,western blot检测自噬相关基因Atg5、LC3和p62的变化;将Atg5 3’UTR重组载体和miR-181c-5p共转染至lncRNA Gas5过表达细胞模型中,检测并计算荧光素酶活性的相对变化,探究lncRNA Gas5影响mi R-181c-5p对其靶基因的调控作用。结果1.与对照组相比,qRT-PCR结果显示lncRNA Gas5在Stravation诱导细胞自噬模型中表达显著上调,而在3-MA处理抑制自噬组中表达明显下调(P<0.05)。Western blot结果显示lncRNA Gas5过表达后促进了LC3II的蛋白表达,同时p62蛋白累积减少(P<0.05),而在lncRNA Gas5敲除后LC3II表达随之减少(P<0.05),p62升高;激光共聚焦和透射电镜结果也显示,过表达lncRNA Gas5确能促进自噬小体的形成。表明lncRNA Gas5能对RAW264.7细胞中自噬关键蛋白产生影响,从而对其细胞自噬起到正向的调控作用。2.生物信息学预测结果发现miR-181c-5p对lncRNA Gas5与Atg5具有相同的靶向结合位点。双荧光素酶靶向验证实验结果显示miR-181c-5p过表达后,共转染Gas5-wt或Atg5 3’UTR-wt组的荧光素酶活性明显下调(P<0.05),而各突变组的荧光酶活性没有显著变化,表明miR-181c-5p可同时靶向结合lncRNA Gas5和Atg5。3.分别定量检测Gas5和sh-Gas5组中miR-181c-5p和Atg5 mRNA的表达量,结果与对照组相比,miR-181c-5p在Gas5组中表达显著下调,Atg5 mRNA却表达上调(P<0.05);相反的是,在sh-Gas5组中,mi R-181c-5p表达显著上调,Atg5 mRNA却下调(P<0.05)。蛋白定量检测结果显示Gas5组中Atg5和LC3II表达都明显增多,而在sh-Gas5组中表达都明显减少,表明lncRNA Gas5对Atg5的蛋白表达有正向调节作用。4.与对照组相比,自噬蛋白Atg5和LC3II在Gas5组中表达增多,在miR-181c-5p mimics组中表达减少,在Gas5/miR-181c-5p mimics共转染组中表达几乎没有变化,而在sh-Gas5/miR-181c-5p mimics共转染组中表达却显著降低,p62与LC3II的表达变化一直呈相反趋势;荧光素酶报告实验结果显示,Atg5 3’UTR-wt与miR-181c-5p共转染组的荧光素酶活性显著下降,但同时转染Gas5后,荧光素酶活性出现回升上调(P<0.05)。表明lncRNA Gas5对Atg5的调控作用是通过抑制miR-181c-5p的功能来实现的。结论研究表明lncRNA Gas5通过竞争性结合mi R-181c-5p,抑制其对Atg5的靶向作用,进而对细胞自噬正向调控。