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第一部分血管内皮功能障碍与脓毒症急性肾损伤的临床相关性研究研究目的:内皮细胞的活化和损伤发生在脓毒症早期,在脓毒症急性肾损伤(Septic Acute Kidney Injury,S-AKI)的病理生理中起重要作用。维持血管内皮正常功能是平衡机体促凝血系统的关键。炎症情况下,内皮细胞活化和损伤介导内外源性凝血途径激活,从而导致机体促凝血功能紊乱引起微血栓形成,进一步加重肾脏微循环功能障碍。临床上常规检测中并无内皮细胞直接来源生物标记物,故本研究通过分析脓毒症患者凝血活性生物标记物与急性肾损伤的相关性,初步探讨血管内皮功能障碍在S-AKI发生发展中的可能作用。研究方法:回顾性观察研究2013年1月1日至2016年12月31日期间在外科重症监护病房(Intensive Care Unit,ICU)收住的诊断为腹腔感染(Intra-Abdominal Infection,IAI)所致脓毒性休克的患者。通过调整基线特征,采用多变量回归法分析凝血活性生物标记物与S-AKI以及病死率之间的关系,包括患者入ICU时部分凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time,APTT)、凝血酶原时间(Prothrombin Time,PT)和D-二聚体等。研究结果:在138例纳入的重症患者中,65名脓毒症患者并发AKI。研究中发现S-AKI患者的序贯器官衰竭评估(Sequential Organ Failure Assessment,SOFA)评分(中位数为12分)、急性生理和慢性健康评估(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation,APACHE)II评分(中位数为27.5分)以及病死率显著升高。分别校正两种模型后,多变量logistic回归分析发现入ICU时内源性凝血活性生物标志物APTT(优势比(Odds Ratio,OR)=1.074,95%置信区间(Confidence Interval,CI)1.030-1.120,P=0.001),外源性凝血活性生物生物标志物PT(OR=1.162,95%CI 1.037-1.302,P=0.010)和纤溶系统活性标志物D-二聚体(OR=1.098,95%CI1.002-1.202,P=0.045)是S-AKI的显著危险因素。此外,Cox多变量回归分析表明,APTT延长(OR=1.065,95%CI 1.025-1.107,P=0.001)与30天病死率独立相关。结论:内皮细胞活化和损伤介导的内源性凝血活性生物标志物(APTT)与脓毒症患者急性肾损伤和病死率显著相关,临床研究提示血管内皮功能障碍在S-AKI发生发展中起重要作用。第二部分S1PR3介导血管内皮功能障碍在脓毒症急性肾损伤中的作用和机制研究研究目的:内皮细胞在维持机体正常生命活动中起重要作用。脓毒症时,循环中的内毒素和炎症介质可以直接损伤或活化内皮细胞。1-磷酸鞘氨醇受体3(Sphingosine-1-Phosphate Receptor 3,S1PR3)是一种主要表达于内皮细胞的G蛋白偶联受体,通过结合配体S1P(Sphingosine-1-Phosphate)介导内皮细胞跨膜信号转导。有研究报道,S1PR3在脓毒症急性肺损伤模型中参与并破坏内皮屏障。然而,S1PR3在S-AKI中的作用机制尚无报道。因此,本研究通过体内和体外实验共同探讨S1PR3受体通过调控内皮细胞功能介导S-AKI发生发展的作用和机制。研究方法:本研究首先通过腹腔注射LPS(Lipopolysaccharide)构建WT小鼠S-AKI模型,采用Western Blot和免疫荧光实验分析内皮细胞上S1PR3受体与S-AKI的相关性。其次,S1pr3+/+(WT)和S1pr3-/-(KO)小鼠腹腔注射LPS建立S-AKI模型,采用流式细胞术、透射电子显微镜和内皮渗透试验测定内皮细胞的活化情况。继而,通过透射电子显微镜分别观察S1pr3+/+和S1pr3-/-脓毒症小鼠肾血管内皮细胞中线粒体的超微结构变化。最后,体外培养人脐静脉内皮细胞探讨S1PR3介导内皮细胞功能障碍的机制。研究结果:WT小鼠腹腔注射LPS后,24h组的血肌酐(Crea)和尿素氮(BUN)水平显著高于0h组、6h组和48h组(P<0.001)。Western Blot显示腹腔注射LPS 24h后,肾组织的S1PR3表达水平明显高于0h组、6h组和48h组(P<0.001)。免疫荧光显示S1PR3主要表达于肾组织内皮细胞。S1pr3+/+和S1pr3-/-小鼠LPS刺激24h后,结果显示,与S1pr3+/+小鼠相比较,S1pr3-/-显著降低脓毒症小鼠Crea和BUN水平(P<0.01),抑制白细胞浸润(P<0.01),保护血管内皮屏障完整性(P<0.01)。LPS刺激24h后,透射电子显微镜观察发现S1pr3+/+小鼠的肾血管内皮细胞出现线粒体肿胀、线粒体嵴断裂和消失等现象。此外,通过ATP检测实验发现,S1pr3+/+小鼠的ATP生成显著低于S1pr3-/-小鼠(P<0.01)。采用体外实验,S1PR3拮抗剂TY-52156(10μM)预处理HUVECs(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)10min后,LPS(1μg/ml)和S1P(0.1μM)共孵育24小时,结果显示,与LPS+S1P组相比较,S1PR3拮抗剂TY-5215有效减少内皮细胞线粒体Ca2+内流(P<0.05),增加ATP生成(P<0.01)。免疫荧光显示,与LPS+S1P组相比较,S1PR3拮抗剂TY-52156保护内皮细胞紧密和粘附连接,维持细胞骨架的正常形态结构。结论:在S-AKI模型中,阻断S1P-S1PR3信号通路可以有效阻止内皮细胞胞外Ca2+内流介导的线粒体钙超载,从而通过抑制内皮细胞活化维持肾血管内皮屏障完整性,起到保护肾功能的作用。第三部分S1PR3特异性拮抗剂TY-52156脂质体的设计、合成和应用研究目的:S1PR3特异性拮抗剂TY-52156可以通过阻止S1P[3H]与胞外S1PR3-CHO区域结合有效抑制胞外Ca2+内流,是靶向治疗S1P-S1PR3信号通路相关疾病的潜在药物。然而,它是一种强疏水性的小分子化合物,只溶于存在组织毒性的有机溶剂二甲基亚砜或乙醇。脂质体(Liposome)是由磷脂分子和胆固醇组成的纳米结构药物递送载体,具有良好的水溶性和生物相容性。因此,为了改善TY-52156的水溶性和生物相容性,同时减轻有机溶剂的组织毒性,本研究设计并合成TY-52156脂质体,同时在小鼠S-AKI模型中验证载药脂质体的生物学作用。研究方法:我们设计了阴离子脂质体(Liposome-Negative-TY-52156,LP-Neg-TY-52156)和中性脂质体(Liposome-Neutral-TY-52156,LP-Neu-TY-52156)。采用薄膜分散法合成两种脂质体。将两种载药脂质体溶于水中,通过透射电子显微镜观察脂质体的纳米结构,采用纳米粒度分析检测脂质体的纳米粒径和Zeta电位。通过细胞实验分别检测载药脂质体预处理内皮细胞10min和30min后的p44/p42 MAPK磷酸化水平,验证两种载药脂质体是否与原药TY-52156具有相同的药效作用。最后,构建小鼠脓毒症模型,术后半小时腹腔注射LP-Neg-TY-52156、LP-Neu-TY-5215和TY-52156,检测肾功能损伤情况。研究结果:将LP-Neg-TY-52156和LP-Neu-TY-52156溶于水中,通过透射电子显微镜观察显示两种载药脂质体均形成纳米结构。纳米粒度分析示LP-Neg-TY-52156的纳米粒径为615.7±131nm,Zeta电位为-33.14±5.515m V;LP-Neu-TY-52156的纳米粒径为1793±212.6nm,Zeta电位为-1.601±3.552m V。Western Blot结果显示,S1PR3拮抗剂预处理细胞10min后,与未加药组相比较,LP-Neg-TY-52156组与TY-52156组的磷酸化水平显著降低(P<0.0001),LP-Neu-TY-5215组无统计学差异。S1PR3拮抗剂预处理细胞30min后,LP-Neg-TY-52156组、LP-Neu-TY-5215组与TY-52156组的磷酸化水平显著低于未加药组(P<0.0001),并且LP-Neg-TY-52156组的磷酸化水平低于TY-52156组(P<0.05)。腹腔注射LPS 24h后,对比于LPS组,TY-52156组(P<0.05)和LP-Neg-TY-52156组(P<0.01)的Crea水平呈明显下降,BUN水平无统计学差异,但表现出下降趋势。结论:药物脂质体改造有效改善TY-52156的水溶性和生物相容性,其中LP-Neg-TY-52156因其良好的生物相容性而具有更好的药效作用,并通过体内实验进一步证明阻断S1P-S1PR3信号通路对S-AKI的发生发展起到一定的防治作用。