论文部分内容阅读
产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是导致人类和幼畜腹泻的重要病原体,其引起的新生及断奶仔猪腹泻(PWD)由于高发病率、高致死率造成巨大经济损失。PWD主要是由表达F4或F18黏附素的ETEC引起,主要毒力因子是F4或F18菌毛。ETECF4有F4ab、F4ac、F4ad三种血清型变异株,其中F4ac最为常见。对这三种变异体基因簇的比较学分析表明,他们唯一的区别就在faeG基因上,其编码的FaeG亚单位也是菌毛主要的功能性亚基。课题组的前期研究发现,猪氨肽酶N(APN)是F4菌毛的直接受体蛋白,FaeG亚单位不仅是有效的黏附亚基,同时也是F4菌毛与APN作用的靶点。因此,本研究首先通过体外细胞和动物感染试验,明确FaeG亚单位在细菌感染中所发挥的作用;然后以APN为靶点,利用FaeG与APN的功能结合域为突破口,对筛选出的FaeG蛋白与APN互作的多肽进行功能性探究,并对关键作用位点进行定点突变,最终筛选出APN-FaeG互作的结合位点,从受体结合角度探究F4三种血清型间的差异,并尝试解答FaeG亚单位在F4ac成为优势血清型中所起的作用。研究一探究F4菌毛的主要亚单位FaeG在细菌感染细胞引起信号通路激活及动物攻毒实验中的作用。F4菌毛的受体蛋白APN与FaeG亚单位之间存在直接的蛋白互作,APN基因的转录与MAPK信号通路密切相关。因此,本研究以MAPK信号通路作为靶标结合仔猪攻毒试验,对FaeG亚单位在其中所发挥的作用进行探索。研究发现,缺失FaeG亚单位的确造成信号通路激活减弱甚至消失,同时进行的F4ac野生菌及faeG缺失株感染断奶仔猪的攻毒实验结果也表明,缺失FaeG亚单位后,仔猪的攻毒效果大大减弱。研究二为了进一步探究三种变体的FaeG蛋白与受体APN的结合差异,以受体蛋白APN为靶点,利用FaeG与APN的功能结合域为突破口,对筛选出的9条多肽进行功能性验证,结合FaeG蛋白的同源建模,以及APN-FaeG蛋白互作的分子对接分析结果,进一步筛选出FaeG蛋白中能够与APN互作的关键位点,并对这些位点进行定点突变,通过激光共聚焦及pull-down实验验证突变后的多肽及FaeG蛋白的作用,最终筛选出的关键位点为:F4abFaeG-V187A、F4acFaeG-G204A、F4acFaeG-N209A、F4acFaeG-L212A、F4acFaeG-G213A。