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[研究背景]乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,发病率和致死率高。发生转移的乳腺癌患者预后不良,但乳腺癌转移的具体机制尚不明确。了解乳腺癌转移的分子机制有助于寻找诊疗靶点,改善患者预后。与线性RNA不同,环状RNA呈闭合环状结构,目前已有研究表明环状RNA参与乳腺癌进展,然而与乳腺癌转移密切相关的环状RNA表达谱及具体机制尚不清楚。本研究通过转录组高通量测序筛选出与乳腺癌转移相关的环状RNA circKDM4B,在乳腺癌组织中检测circKDM4B的表达,研究circKDM4B在体内、外对乳腺癌生长和转移的影响,通过circKDM4B-miRNA-靶基因的竞争性内源RNA调控网络阐释circKDM4B调控乳腺癌转移的具体机制。[研究方法]利用转录组高通量测序筛选出与乳腺癌转移相关的环状RNA circKDM4B,使用实时荧光定量PCR检测circKDM4B在临床样本和乳腺癌细胞中的表达。通过放线菌素D及RNase R处理细胞,检测circKDM4B的RNA稳定性。利用RNA核质分离和荧光原位杂交实验明确circKDM4B在细胞内的定位。通过Transwell实验观察circKDM4B对乳腺癌细胞迁移、浸润的影响,利用CCK-8和EdU实验观察circKDM4B对乳腺癌细胞生长和增殖能力的影响。构建荷瘤裸鼠模型,观察circKDM4B在体内对乳腺癌细胞生长、转移的影响。通过网站预测circKDM4B可能结合的miRNA及miRNA对应靶基因,结合RNA免疫沉淀实验和双荧光素酶实验等证实circKDM4B与miRNA结合、miRNA与靶基因结合。通过免疫沉淀实验、酶联免疫吸附实验、体外小管形成实验及western blot实验进一步证实circKDM4B-miRNA-靶基因调控网络对乳腺癌转移的调控作用。[研究结果]1.CircKDM4B在乳腺癌组织中表达显著下调通过转录组高通量测序筛选出与乳腺癌转移相关、在转移组中表达显著降低的环状RNA hsacirc0002926（随后将其命名为circKDM4B）。在临床样本中验证circKDM4B的表达,发现与非肿瘤组织相比,乳腺癌组织中circKDM4B表达显著下调,且转移组circKDM4B表达较非转移组下调。此外,circKDM4B在永生化乳腺上皮细胞MCF 10A及低侵袭力的乳腺癌细胞（MCF-7和T47D）中表达较高,而在高侵袭力的乳腺癌细胞（MDA-MB-231和MDA-MB-468）中表达较低。放线菌素D及RNase R处理细胞,circKDM4B较线性转录本更稳定。RNA核质分离和荧光原位杂交实验证实circKDM4B主要定位于胞浆。2.CircKDM4B抑制乳腺癌细胞迁移、浸润能力在乳腺癌细胞中过表达circKDM4B能显著增加circKDM4B的表达水平而对线性转录本表达没有显著影响;干扰circKDM4B能明显降低circKDM4B的表达水平而不引起线性转录本的表达变化。Transwell实验显示circKDM4B显著抑制乳腺癌细胞的迁移、浸润能力。CCK-8和EdU实验显示circKDM4B对乳腺癌细胞的生长和增殖能力没有明显作用。3.CircKDM4B作为分子海绵吸附miR-675RNA免疫沉淀实验显示circKDM4B与AGO2蛋白结合,提示circKDM4B通过与miRNA结合发挥作用。通过RegRNA2.0网站预测circKDM4B可能结合的miRNA,结合文献报道筛选出7个具有促癌作用的miRNA,包括miR-18a、miR-20a、miR-27a、miR-187、miR-196a、miR-346 和 miR-675。双荧光素酶实验显示在 MDA-MB-231 细胞中miR-27a和miR-675能下调circKDM4B的相对荧光素酶活性,而在MDA-MB-468细胞中miR-196a和miR-675能下调circKDM4B的相对荧光素酶活性,其他miRNA没有显著作用。此外,双荧光素酶实验显示miR-27a、miR-196a和miR-675这三个miRNA对circKDM4B的相对荧光素酶活性没有协同作用,由于miR-675在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中均能下调circKDM4B的相对荧光素酶活性,因此我们将miR-675作为主要研究目标。将miR-675与circKDM4B的结合位点突变后,miR-675对circKDM4B荧光素酶活性的抑制作用消失。实时荧光定量PCR显示miR-675对circKDM4B的表达没有明显影响,circKDM4B亦不能引起miR-675的显著变化。生物素标记的RNA下拉实验显示miR-675能与circKDM4B结合。Transwell实验显示miR-675促进乳腺癌细胞迁移、浸润,且能逆转circKDM4B对乳腺癌细胞迁移、浸润的抑制作用。4.circKDM4B通过吸附miR-675上调靶基因NEDD4L蛋白表达考虑到miR-27a和miR-196a也能够与circKDM4B结合,因此我们通过Targetscan网站检索miR-675靶基因的同时也检索了 miR-27a和miR-196a的潜在靶基因,将三者的靶基因取交集并结合文献报道,我们筛选到抑癌因子NEDD4L与circKDM4B功能一致,作为研究目标进行验证。双荧光素酶报告基因实验显示miR-675下调NEDD4L的相对荧光素酶活性,circKDM4B上调NEDD4L的相对荧光素酶活性。将miR-675和NEDD4L的结合位点突变后,miR-675和circKDM4B均不能影响NEDD4L的相对荧光素酶活性。Western blot实验显示miR-675抑制NEDD4L蛋白表达,而circKDM4B呈剂量依赖性促进NEDD4L蛋白表达。通过实时荧光定量PCR检测NEDD4L在临床样本中的RNA表达,发现与非肿瘤组织相比,乳腺癌中NEDD4L表达显著降低。利用免疫组化检测NEDD4L蛋白在乳腺癌组织中的表达,并与circKDM4B的RNA表达水平进行相关性分析,发现二者呈显著正相关。5.CircKDM4B通过miR-675/NEDD4L轴促进PI3KCA泛素化进而抑制PI3K/AKT通路以及VEGFA的表达免疫沉淀实验发现乳腺癌细胞中敲低NEDD4L抑制PI3KCA泛素化,过表达circKDM4B 促进 PI3KCA 泛素化。敲低 circKDM4B,P13KCA、p-AKT（Ser473）及 VEGFA表达增加。过表达circKDM4B,PI3KCA、p-AKT（Ser473）及VEGFA表达降低,且这一作用可被miR-675逆转。酶联免疫吸附实验显示,过表达野生型circKDM4B而非突变型circKDM4B抑制VEGFA分泌,敲低circKDM4B后VEGFA分泌增加。Transwell和体外小管形成实验显示circKDM4B抑制人脐静脉内皮细胞迁移和小管形成。6.CircKDM4B可能成为治疗乳腺癌的潜在靶点皮下移植瘤模型中,circKDM4B表达升高显著抑制移植瘤的生长、局部浸润和肺转移。尾静脉转移瘤模型中,circKDM4B表达增加显著抑制肺转移。免疫组化实验显示circKDM4B表达增加能显著抑制瘤体内血管生成。Western blot实验显示瘤体内circKDM4B 表达升高能增加 NEDD4L 表达而减少 PI3KCA、p-AKT（Ser473）及 VEGFA表达。[结论]环状RNA circKDM4B在乳腺癌中表达降低,circKDM4B作为分子海绵吸附miR-675上调NEDD4L表达,后者促进PI3KCA泛素化,进而抑制PI3K/AKT通路及VEGFA分泌,抑制乳腺癌生长和转移。