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细胞培养和以抗体为基础的免疫学技术仍然是目前病毒学研究的基本方法。尽管在医学病毒研究领域已有相对成熟的细胞系和抗体制备系统，但在低等脊椎动物(如鱼类)病毒学研究中，这方面的信息需要更多积累。另外，从分子水平上对病毒功能基因进行鉴定可为病毒防治提供理论基础。本论文结合能严重危害我国水产经济鱼类的重要病毒病原——弹状病毒，主要开展以下三个方面的研究，内容如下：
1、两株鱼类新细胞系的建立及其初步应用：分别取来源于淡水的中华鲟(Chinesesturgeon)和来源于海水的赤点石斑鱼(Red spotted grouper)的鳍条和吻端组织为材料，建立用于鱼类病毒分离和鉴定的细胞系，分别称为GS(Grouper snout)和CSTF(Chinesesturgeon tail fin)细胞系，并从细胞形态、生长曲线、核型等角度进行了鉴定，在病毒感染性和外源基因转染方面进行了初步应用。结果显示GS是成纤维细胞，而CSTF是上皮样多边形，25℃下两者都能在含10％小牛血清FBS的DMEM培养液中贴壁生长。在不加FBS的培养液条件下CSTF细胞不能正常贴壁，而GS细胞虽能贴壁但生长几乎停滞。CSTF细胞在同样培养条件下能维持时间较长，耗营养液较少。目前两株细胞系都传代超过了60代，均保持二倍体核型，染色体众数分别达到48条(GS)和264条(CSTF)，只是后者包含有更多的点状染色体。细胞对病毒的敏感性测定表明大菱鲆弹状病毒(Scophthalmus maximus rhabdovirus，SMRV)和蛙虹彩病毒(Rana grylio virus，RGV)均能感染GS细胞系，而只有RGV能感染CSTF细胞。荧光显微镜和电镜观察均可见在受感染细胞的胞质内有子代病毒病原出现。eGFP真核表达载体转染到两种细胞系后，24 h内即可明显看到细胞内有绿色信号荧光蛋白的表达，显示其在转基因研究中的潜在应用价值。
2、SMRV和PORV(Paralichthys olivaceus rhabdovirus，PORV)单抗制备及鉴定：在鱼类细胞系上分别扩增两株病毒，并用蔗糖梯度超速离心纯化病毒病原。将病毒抗原免疫Balb/c小鼠后，经细胞融合、筛选和有限稀释等程序分离能分泌SMRV和PORV特异性抗体的细胞株。对所制备抗体从亚类和识别抗原能力等方面进行了鉴定，并在细胞和组织水平上分别进行了应用。结果表明，在所分离的5株SMRV单抗(抗体分别定名为1G8、1H9、2D2、2D3和2F5)和2株PORV单抗(抗体定名为3C7和3C9)中，除了1G8和1H9为IgG2b之外，其它几株均为IgM。Western blotting分析表明，抗SMRV的五株抗体能同SMRV的两条结构蛋白发生反应(约26kDa和30kDa)，而3C7和3C9能识别PORV的三个结构蛋白，分子量分别为42kDa、30kDa和22kDa。利用所制备的抗体做免疫荧光实验，均能在受病毒感染的细胞胞质内看到病毒病原；而用其中的两株抗体2D3和3C7分别去捕获SMRV感染的牙鲆和PORV感染的草鱼鱼体组织冰冻切片上的病原也显示了较强的阳性信号。流式细胞术用于对弹状病毒感染的鱼类细胞进行计数，显示SMRV(0.01PFU/cell)和PORV(0.25PFU/cell)分别感染EPC(Epithelioma papulosum cyprini)和GCO(Grass carp ovary)细胞36 h后，分别用2D3和3C7作为一抗同细胞内的病原反应，细胞感染率分别达到总数的10.8％和23％。
3、鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV)核蛋白N的功能初步分析：将四个针对N基因mRNA序列不同位点的特异siRNA分别转染EPC细胞，5 h后用SCRV病毒感染细胞。通过细胞病变观察、Western blotting和病毒滴度测定等角度检验RNA干扰效应，结果最终筛选出si983(距AUG有983bp)具有最好的抑制效果。Westernblotting分析显示si983能显著降低N蛋白的表达，而且这种抑制具有剂量依赖的效应。此外，si983和N基因的真核表达载体共转染后N蛋白表达量也显著下降。而特异性沉默N蛋白能显著降低病毒在细胞内的滴度，表明N蛋白对病毒的复制是必需的。
病毒感染和N基因的真核表达载体转染到EPC细胞后，除了全长的约47kDa的N蛋白之外，Western blotting还检测到两个分子量大小约为41kDa和35kDa的小蛋白带。上述两种情况下细胞的caspase-3酶活性上升，当用caspases抑制剂z-VAD-FMK(终浓度100μM)处理后，N蛋白的剪切现象消失或变弱，但不会影响子代病毒在细胞内的产量。据此，确定N蛋白的特异性剪切是由caspases酶介导的。根据caspases酶的切割蛋白特点，我们构建了起始或终止位点不同的N基因缺失片段GFP表达载体，分别为N1-GFP(aa1-376)、C1-GFP(aa377-429)、N2-GFP(aa1-281)、C2-GFP(aa282-429)和C3-GFP(aa325-429)。分别转染EPC细胞48 h后收样做Western blotting分析，比较各片段表达蛋白分子量差异和在细胞内的剪切片段大小，初步鉴定了N蛋白的两个caspases酶切位点，即D324和D374。这也是有关弹状病毒核蛋白剪切现象的首次报道。