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目的:观察肝纤维化大鼠Bcl-2、Bax、PCNA的表达及重组TGF-β1疫苗对其表达的影响,探讨肝细胞凋亡、增殖与肝纤维化的关系及重组TGF-β1疫苗对凋亡因子及核增殖抗原表达的影响。
方法:1.动物分组与喂养:健康雄性Sprague-Dawley系大鼠30只,体重80-100g,随机分为3组:A组(正常组10只),B组(肝纤维化模型组10只),C组(TGF-β1疫苗治疗组10只)。所有大鼠均在室温恒定(20-25℃)及灯光昼夜节律控制(8:00-20:00)下普通喂养,自由进食、进水,实验前12h开始禁食。2.肝纤维化动物模型的建立:肝纤维化模型组以0.5%的二甲基亚硝胺(DMN)按0.2ml/100g的剂量腹腔内注射,每周前3天每天1次,连续4周;重组TGF-β1疫苗(之前在本实验室合成)治疗组在注射二甲基亚硝胺的基础上于第一周第一天在背部皮下注射疫苗150μg,注射前疫苗用弗氏完全佐剂(FCA)充分混匀乳化,第三周第一天疫苗用弗氏不完全佐剂(FIA)充分混匀乳化后每只老鼠背部皮下注射疫苗150μg。3.取材与切片:第42天处死各组大鼠,先用10%水合氯醛0.35ml/kg麻醉,剖腹经下腔静脉采血,取出肝组织立即用中性福尔马林固定12h,之后脱水透明石蜡包埋。4.免疫组织化学染色:采用S-P免疫组织化学方法染色组织切片,每次染色时用试剂公司提供的TGF-β1、Bcl-2、Bax和PCNA阳性片作阳性对照,PBS代替第一抗体作为阴性对照。每张切片随机选取5-10个高倍视野(×400),计算每1000个肝细胞中的TGF-β1、Bcl-2、Bax和PCNA的阳性细胞数,5.HE染色、Masson染色与组织学观察:切片经苏木素-伊红染色及Masson三色染色后普通光学显微镜下观察肝组织结构的变化。6.肝功能及HA、LN的检测:经下腔静脉所采的血标本,全自动生化分析仪检测ALT、AST、Alb,放免法检测HA、LN。
结果:1.动物用DMN造模后毛色灰暗,精神萎靡,进食进水减少,易受惊,体重增长缓慢。血清ALT、AST明显升高,白蛋白明显下降。模型组肝病理学表现为正常小叶结构破坏或消失,由汇管区和中央静脉伸出粗大胶原纤维条索分割、包绕肝小叶,肝细胞索排列紊乱,肝细胞浊肿明显,纤维隔内有大量炎性细胞及成纤维细胞等浸润,这表明肝纤维化模型成功建立。与模型组相比,TGF-β1疫苗治疗组肝细胞坏死、纤维组织增生减少,肝小叶结构破坏减轻,纤维条索疏松变窄,肝细胞水肿好转,肝内炎症细胞浸润减少。TGF-β1疫苗治疗组ALT、AST水平较模型组明显减低,白蛋白明显升高。2.促凋亡相关因子bax与大鼠肝脏病理分级正相关,而抗凋亡相关因子bcl-2与大鼠肝脏病理分级负相关,bcl-2/bax与肝脏病理分级负相关,PCNA与大鼠肝脏病理分级无相关性。3.正常组大鼠肝组织中TGF-β1、Bax表达水平较低,明显低于模型组(P<0.01),Bcl-2表达水平与模型组相当,无显著差异。但TGF-β1疫苗治疗组肝组织中TGF-β1表达明显下降,Bcl-2表达水平明显升高,与模型组相比有统计学差异(P<0.05),而Bax表达水平与模型组相当,无显著性差异。4.模型组PCNA的水平较正常组高,有显著性差异(P<0.01),但经TGFβ1疫苗治疗后,治疗组PCNA的水平较模型组又明显提高,有显著性差异(P<0.01)。
结论:1、促凋亡相关因子bax与大鼠肝脏病理分级正相关,而抗凋亡相关因子bcl-2、bcl-2/bax分别与大鼠肝脏病理分级负相关。PCNA与大鼠肝脏病理分级无明显相关性。
2、TGF-β1疫苗能改善肝纤维化大鼠肝脏病理组织学结构,使血清生化指标明显好转。
3、肝细胞凋亡是引起肝纤维化的可能机制之一。TGF-β1疫苗可能通过影响肝纤维化大鼠Bcl-2、Bax、PCNA的表达而影响肝细胞的凋亡和增殖,从而改善肝脏病理分级。