瓜伊科库蚊病毒编码NSP2蛋白解旋酶与RNA分子伴侣活性研究

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瓜伊科库蚊病毒(GCXV)属于Jingmen病毒组,是一种基因分节的正链RNA多分体病毒。它们的基因组具有与黄病毒属高度同源的核酸序列,一些学者根据其基因组信息,认为可以划入到黄病毒科,成为其中独特的一组。Jingmen病毒组的发现和建组比较晚、研究较少。目前的主要研究方向是新病毒的发现、鉴定和系统发育分析,有关其编码蛋白的具体功能的相关研究并不充分。对于RNA病毒来说,其基因组RNA有多个顺式作用元件,它们在病毒的复制、转录和翻译等过程中起到至关重要的作用。这些元件需要正确的折叠才能行使正确的功能,但是细胞内RNA分子容易陷入错误的折叠状态,此时就需要包括RNA解旋酶和RNA分子伴侣在内的RNA重塑蛋白提供帮助,解开错误折叠形成的双链,促进RNA形成正确的构象,因此RNA重塑蛋白在病毒生命周期中起到关键作用。RNA重塑蛋白中的RNA解旋酶通常高度保守,根据包含的保守基序被分成六个超家族(SF1-SF6),具有NTPase活性、RNA结合活性和NTP依赖的解旋活性,能够解开双链RNA,帮助打开错误折叠的RNA二级、三级结构,从而对RNA分子进行重塑。相反,RNA分子伴侣之间通常在氨基酸序列上不保守,解开双链RNA的过程也不依赖NTP。在前期研究中,研究人员通过蛋白同源性比对分析,发现Jingmen病毒组的NSP2蛋白与黄病毒属NS3蛋白在蛋白质水平同源,而黄病毒属NS3蛋白是已知的经典SF2超家族解旋酶,在黄病毒属的生活周期中起到重要作用。在此基础上,我们将GCXV的NSP2氨基酸序列与蛋白库中的数据进行比对,发现GCXV NSP2具有SF2超家族解旋酶的多个保守基序,因此我们推测它应该也是SF2超家族解旋酶。我们通过真核表达系统体外纯化了GCXV NSP2蛋白并进行了一系列体外实验,发现NSP2蛋白具有水解NTP的NTPase活性以及解开双链RNA的解旋活性。同时我们研究了NSP2解旋的最适反应条件,发现NSP2的解旋活性是Mg2+依赖的。NSP2的解旋活性不具有方向性,但是具有底物特异性,只能解开RNA双链而不能解开DNA双链和DNA/RNA杂合链。另外我们发现,在没有NTP的条件下NSP2仍然可以部分的解开双链RNA,因此我们认为NSP2具有不依赖NTP的RNA分子伴侣活性。通过经典的RNA退火实验,我们发现NSP2可以打开单链RNA的二级茎环结构、促进两条互补的RNA单链退火形成双链,并且退火的效率会根据时间和蛋白浓度的增加而增加。通常RNA解旋酶和分子伴侣被认为是两种不同的RNA重塑蛋白,但我们的研究证明GCXV NSP2同时具有这两种蛋白功能。因此,对于包括GCXV在内的Jingmen病毒来说,行使解旋酶和RNA分子伴侣功能的NSP2在病毒的生活周期中也至关重要。
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