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为了阐明虫酰肼对斜纹夜蛾幼虫多巴脱羧酶的作用机理,本试验以斜纹夜蛾为研究材料,克隆斜纹夜蛾多巴脱羧酶基因cDNA全长,研究虫酰肼对表皮形成过程中多巴脱羧酶基因表达的影响。主要研究结果如下: 1、本研究通过RT-PCR和RACE技术克隆得到斜纹夜蛾多巴脱羧酶基因的cDNA全长。通过生物信息学工具对斜纹夜蛾多巴脱羧酶基因的DNA序列及其编码的蛋白质序列进行分析。该基因具有一个完整的开放阅读框,长1263bp,编码420个氨基酸,5端非编码区长105 bp,3端非编码区长79 bp。克隆得到的cDNA全长提交至GenBank,登录号为KF620492。多重序列比对及系统进化树显示斜纹夜蛾DDC基因推导的氨基酸序列与鳞翅目昆虫的DDC序列具有很高的相似性。利用SWISS-MODEL在线工具进行同源建模,成功预测斜纹夜蛾DDC三维结构,其与果蝇属(Drosophila)的多巴脱羧酶空间结构具有很高的相似性,功能结构域具有良好的保守性。 2、采用饲料浸毒法测定虫酰肼对斜纹夜蛾不同龄期幼虫的毒力,测定虫酰肼对斜纹夜蛾3、4、5和6龄幼虫的毒力,其LC50分别为33.32、40.28、71.20和71.97 mg/L。表明虫酰肼对斜纹夜蛾幼虫的毒力随幼虫龄期的增长而降低。 3、采用荧光定量PCR技术,测定斜纹夜蛾幼虫不同时间内以及斜纹夜蛾不同发育阶段的多巴脱羧酶基因动态表达量。结果表明,多巴脱羧酶基因在幼虫蜕皮前后均有高表达,蜕皮12h之后表达量明显降低,12~48 h处于相对低表达量水平;随着龄期的增长,多巴脱羧酶基因的表达量递增。该基因在斜纹夜蛾整个发育过程中均有表达。卵期表达量最高。 4、利用荧光实时定量PCR检测用亚致死剂量虫酰肼处理的斜纹夜蛾幼虫DDC基因的表达水平。用虫酰肼分别处理12~48 h,4个亚致死剂量诱导的DDC表达水平均高于对照,随着处理时间的延长和处理浓度的升高激活作用呈现出先上升后下降的趋势。处理24~36h,LC20~LC30浓度范围内的激活作用最高。处理60h,4个亚致死剂量处理的DDC相对表达量大幅下降,表达水平均低于对照。研究结果表明虫酰肼进入虫体后先启动基因表达,而后抑制表达;虫酰肼干扰昆虫幼虫蜕皮与其影响表皮形成过程中多巴脱羧酶基因的表达有关。