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目的:过度训练引起的心肌损伤(overtraining-induced acute myocardial injury,OTIAMI)是猝死的重要原因之一,目前临床上尚缺乏有效的防治措施。因此,如何进一步认识OTIAMI的发病机制,探索其防治措施是目前运动医学、军事医学和临床医学面临的重大课题。但以往的研究多局限于形态和功能的探讨,而对引起心肌损伤的分子机制缺乏系统研究,这就影响了对OTIAMI发病机制的认识和防治措施的探索。最近研究发现,心肌细胞凋亡在OTIAMI中发挥重要作用。但有关OTIAMI时心肌细胞凋亡机制以及细胞内信号转导的主要途径尚不清楚。药物筛选研究表明,山莨菪碱具有抗心肌缺血再灌注损伤,减轻TNF-α所致的内皮细胞凋亡;旋覆花素可通过抑制炎症信号转导途径影响细胞的凋亡;苦碟子具有清除自由基抗氧化作用;这三种药物对各种原因引起的组织缺血缺氧具有拮抗作用,但它们能否干预过度训练所致的急性心肌损伤值得探讨。本研究通过让大鼠游泳至力竭,建立大鼠过度训练致急性心肌损伤模型,研究过度训练引起心肌损伤的特征,阐明心肌损伤过程中心肌细胞凋亡机制及Caspase凋亡相关信号传导通路的作用,观察山莨菪碱、旋覆花素和苦碟子对OTIAMI的防治作用,以期加深对OTIAMI分子发病机制的认识,为临床OTIAMI的防治提供新的实验依据和措施。方法:将80只雄性Wistar大鼠(体重200～220g)随机分为安静对照组(control,CN,n=8)、力竭运动组(exhaustive swimming,ES,n=24)、山莨菪碱干预组(Anisodamine,AD,n=16)、旋覆花素干预组(Inula Britannica,IB,n=16)、苦碟子干预组(Ixeris Sonchifolia,IS,n=16)。CN组为安静对照;ES组又根据力竭后恢复时间分为力竭后即刻(ESI)、力竭后6h(ES 6h)和力竭后24h (ES 24h);AD组于力竭运动前20min腹腔注射山莨菪碱10 mg/kg后进行力竭运动,分为AD 6h和AD 24h组;IB组于力竭运动前24h分三次口腔灌入旋覆花素25ml/kg(含ABL65 mg/kg/d)后进行力竭运动,分为IB 6h和IB 24h组;IS组于力竭运动前20min腹腔注射苦碟子注射液20g/k(g含总黄酮8mg/kg和腺苷0.05mg/kg)后进行力竭运动,分为IS 6h和IS 24h组。每个时间点8只大鼠。采用游泳力竭法建立大鼠过度训练致急性心肌损伤模型,于实验结束时分别检测各组大鼠血清磷酸肌酸激酶(CK)及磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB),心肌组织结构的改变和心肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的变化;比较不同药物处理对力竭致心肌损伤的防治作用和对心肌细胞凋亡的干预影响。实验数据用均数±标准差(ˉx±s)表示,用SPSS 12.0软件包进行统计学分析,组间差异用单因素方差分析,以P <0.05为有统计学意义。结果:1过度训练致大鼠心肌细胞凋亡及山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子的影响为了探讨过度训练引起心肌损伤的特征,阐明心肌细胞凋亡在过度训练致心肌损伤过程中的作用,寻求防治OTIAMI的药物,本部分实验观察了过度训练大鼠心肌形态、功能和代谢的变化及山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子干预的影响。实验结果如下:1.1血清CK及CK-MB的变化:血清CK及CK-MB水平是评价心肌损伤的重要指标。与对照组相比,力竭后即刻、力竭后6h大鼠血CK及CK-MB明显升高(P <0.05),且力竭后6h明显高于力竭后即刻大鼠(P <0.05);力竭后24h大鼠血CK及CK-MB均恢复到对照组水平(P >0.05)。山莨菪碱、旋覆花素及苦碟子组大鼠力竭后6h与同期力竭组比较,血CK及CK-MB明显降低(P <0.05),三种药物之间比较无明显差别。结果提示,过度训练可导致心肌细胞的损伤,上述三种药物可减轻这种变化。因此,本实验又观察了心肌形态的变化。1.2心肌形态的变化:HE染色发现,力竭后即刻大鼠仅见部分心肌纤维肿胀肥大,偶见心肌间血管及毛细血管扩张,力竭后6h及24h可见部分心肌细胞的细胞核深染,有固缩现象。山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子组大鼠力竭后6h及24h心肌形态的变化明显减轻。电镜观察发现,力竭后即刻、6h及24h大鼠均可见心肌细胞核周围和肌纤维明显水肿,核内染色质也明显水肿,肌纤维中细胞器数量明显减少,线粒体部分水肿,部分嵴排列紊乱,部分嵴和膜融合或消失,糖原数量显著减少。山莨菪碱、旋覆花素及苦碟子6h及24h大鼠心肌超微结构变化明显减轻。TUNEL法及流式细胞术检测显示,力竭后即刻大鼠心肌细胞凋亡率明显高于对照组(P <0.05),力竭后6h大鼠心肌细胞凋亡率增高更加明显(P <0.05),力竭后24h大鼠心肌细胞凋亡率与力竭后6h比较有所降低,但无统计学意义,仍明显高于力竭后即刻和对照组(P <0.05)。山莨菪碱、旋覆花素及苦碟子组大鼠于力竭后6h及24h,心肌细胞凋亡率与同期力竭组比较均明显降低(P <0.05),但仍明显高于对照组。上述结果说明,过度训练可引起心肌组织结构及超微结构轻微改变,心肌组织细胞凋亡明显增多,提示过度训练可引起急性心肌损伤,心肌细胞凋亡是OTIAMI的主要损伤特征和细胞学基础,也是OTIAMI的重要发病机制,三种药物均具有明显的抗凋亡和心肌保护作用。1.3血清和心肌组织中SOD及MDA的变化:氧化应激反应增强是心肌缺血再灌注损伤的重要机制。本研究结果表明,力竭后不同时间大鼠血清和心肌组织SOD呈一过性降低,于力竭后6h达最低值(P <0.05),MDA则呈相反趋势变化,两种指标于力竭后24h恢复达对照水平。山莨菪碱、旋覆花素及苦碟子对力竭所致的SOD水平降低和MDA水平升高具有逆转作用。结果说明,过度训练可引起大鼠氧化应激反应增强,三种药物均有明显的抗氧化作用,进而对心肌起到明显的保护作用。2过度训练致大鼠心肌细胞凋亡相关基因表达及山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子干预的影响为了探讨力竭所致的心肌细胞凋亡的机制,本研究进一步观察了力竭及药物干预下心肌组织凋亡相关基因表达的变化。结果显示,力竭后即刻和6h组大鼠心肌Bax的表达水平进行性增强(P <0.05),Bcl-2的表达水平则表现相反的进行性减弱(P<0.05),Bax/Bcl-2比值增高(P <0.05);力竭后24h组大鼠心肌Bax和Bcl-2的表达水平逐渐恢复并接近至对照水平(P <0.05)。应用山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子6h组大鼠与同期力竭组比较,心肌组织Bax的表达减弱(P <0.05),Bcl-2的表达增高(P <0.05),Bax/Bcl-2比值降低(P <0.05),山莨菪碱和旋覆花素使Bax/Bcl-2比值降低比苦碟子更为明显(P <0.05) ;应用山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子24h组大鼠与同期力竭组比较,心肌组织Bax的表达减弱(P <0.05),Bcl-2的表达增高(P <0.05),Bax/Bcl-2比值降低(P <0.05)。各组大鼠心肌组织Bax/Bcl-2比值与心肌细胞凋亡率呈明显正相关性(r=0.727,P <0.01)。结果表明,过度训练可使心肌Bax和Bcl-2比例失衡,进而导致心肌细胞凋亡;三种药物可通过调整凋亡相关基因表达的平衡而阻止过度训练诱导的心肌细胞凋亡。3 Caspase凋亡相关信号传导通路在过度训练致大鼠心肌细胞凋亡中的作用为了探讨过度训练诱导心肌细胞凋亡的信号通路,本研究用免疫组化和流式细胞术分析检测了一组凋亡相关信号分子在力竭后不同时间的表达变化。结果显示,力竭后即刻心肌组织中TNF-α、Caspase-8、Caspase-9和Bid蛋白的表达明显增强(P <0.05),力竭后6h心肌组织四种蛋白的表达明显高于力竭后即刻和对照组(P <0.05),力竭后24h这些蛋白在心肌组织中的表达明显低于力竭后6h组(P <0.05),但仍明显高于力竭后即刻和对照组(P <0.05)。与上述四种凋亡相关信号分子不同的是心肌NF-КB的变化,在力竭后不同时间,大鼠心肌组织中NF-КB表达呈进行性升高,持续到力竭后24h,且各组之间均具有显著性差异(P <0.05)。心肌组织中Fas-L的变化趋势与TNF-α等蛋白的表达水平基本相似,只是在力竭后24h下降幅度不及TNF-α。结果表明,TNF-α、NF-КB、Fas-L、Caspase-8、Caspase-9和Bid蛋白参与介导力竭所致的心肌细胞凋亡;同时也反映出短暂力竭只引起凋亡相关蛋白的瞬时表达改变。提示短时间力竭所致的心肌损伤具有可逆性,可在较短时间内恢复,这为药物防治提供了有利时机。4山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子对过度训练大鼠心肌Caspase相关凋亡信号转导通路的影响为了确定山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子逆转力竭诱导的心肌细胞凋亡是否与干预凋亡相关信号转导有关,继而观察了三种药物对Caspase相关信号分子表达的影响。结果表明,给予三种药物的大鼠在力竭后6h和24h检测到的TNF-α、NF-КB、Fas-L、Caspase-8、Caspase-9和Bid蛋白水平均较未用药组明显降低(P <0.05),但尚未恢复到对照水平。在作用强度上,山莨菪碱和旋覆花素的效果比苦碟子更显著。结果提示,三种药物可不同程度消弱凋亡信号的转导。结论:1游泳所致短暂力竭可引起心肌细胞凋亡与损伤,但病变较轻,机体可在短时间内使受损心肌得到修复。结果提示,及时采取药物干预是OTIAMI防治的关键。2力竭诱导的心肌细胞凋亡与其破坏Bax/Bcl-2平衡、上调Caspase相关信号蛋白的表达、强化凋亡信号转导有关。3山莨菪碱、旋覆花素和苦碟子通过抑制凋亡相关基因表达减缓力竭诱导的心肌细胞凋亡,保护心肌结构的完整性,三种药物均具有良好的心肌保护功效。