目的:1.利用碱性蛋白酶和胰蛋白酶先后对林蛙皮进行水解,提取其含有的透明质酸,然后采用响应面分析法对最佳提取工艺条件进行探索。2.研究透明质酸粗品的纯化、脱蛋白及脱色素处理获得较高纯度的透明质酸精品;再分析研究其外观、物理性质、分子量、成品质地等。3.制备成透明质酸化妆水,探讨它的保湿性。方法:1.以林蛙皮作为实验提取材料,衡量提取工艺的指标为透明质酸提取得率。首先进行单因素实验,由此实验找到比较重要的影响因素;采用响应面分析的统计学方法,优化实验设计;以碱性蛋白酶和胰蛋白酶两种酶水解提取时的酶解温度、酶解时间(碱性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解时间相等)、加酶量(加入的碱性蛋白酶和胰蛋白酶的酶活力相等)3种因素作为自变量,探索3种因素及其交互作用对透明质酸提取得率的影响。2.提取出的透明质酸粗品,首先经过季铵盐沉淀法纯化;再通过Sevag法脱蛋白;最后用H2O2进行脱色后,干燥得到透明质酸精品。3.对通过最佳条件提取的透明质酸进行分析与测定,采用Sephadex凝胶色谱法对其相对分子质量进行测定;并利用考马斯亮蓝法对其进行蛋白质含量的测定及采用平板菌落计数技术测定细菌总数。4.透明质酸化妆水的制备及保湿效果的评价。提取的透明质酸精品以水为溶剂制备成溶液,通过重量法对其进行初步的保湿性评价。随后制备成添加防腐剂和增稠剂透明质酸化妆水:以昆明种小鼠为实验对象,先对其进行皮肤和口服急性毒理性实验;再将不同浓度的透明质酸化妆水涂抹在小鼠脱去毛发的背部,通过短期试验(6h)和长期试验(15d)两种方法探索这种化妆水的保湿性。结果:1.通过单因素试验得出加入酶的量、酶解温度及酶解时间3个因素对透明质酸提取得率影响较大,再通过响应面分析法,确定最佳提取工艺条件为:加入双酶量55000 U/g、酶解温度50℃、酶解总时间14 h。在上述条件下,做3次平行实验,取其平均值,得到最佳提取得率为27.68 mg/g,与模型预测值27.46 mg/g基本相符,其相对误差约为0.85%。2.透明质酸精品纯度为92.0%,葡萄糖醛酸占42.2%,蛋白质的含量<10.0%,符合食品与化妆品级别。3.透明质酸精品的定性分析:外观及物理性质的符合要求;凝胶色谱法测得HA的相对分子质量分别为8.5×105、9.2×105,分子量的数值在40～100×104的范围内,属于低分子范畴;细菌总数检测结果为60 cfu/mL,符合国家行业标准规定。4.自制的透明质酸经小鼠的皮肤和口服的急性毒性试验中,未出现中毒及死亡情况,说明从林蛙皮提取得到的透明质酸产品对小鼠无毒副作用。对小鼠皮肤经过保湿性研究,实验组1(5mL/kg)和实验组2(10mL/kg)的皮肤含水量(%)分别为71.66±1.68、72.61±1.65,空白组为69.54±1.30,阳性对照组为72.32±2.06,实验组小鼠皮肤含水量明显优于空白对照组,具有显著性差异,p<0.05;和阳性对照相比,无显著性差异,p>0.05;说明从林蛙皮提取得到的透明质酸产品具有保湿性。透明质酸化妆水组分配方:透明质酸粉末0.5-1,A 0.1,PEG-150二硬脂酸酯0.1,水 98.8-99.3。通过短期(6 h)试验,自制透明质酸(0.5%,1%)和购买的透明质酸(0.5%)与空白试验组相比不具有显著性差异,p>0.05,得到透明质酸化妆水在短期内基本上无保湿作用;通过长期(15 d)实验作用,自制透明质酸(0.5%,1%)和购买的透明质酸(0.5%)与空白试验组相比均具有显著性差异,并且浓度越高保湿效果越显著,此外相同浓度的自制的HA化妆水与购买的HA化妆水在保湿效果上基本相同,说明自制的透明质酸化妆水具有保湿性。结论:1.通过响应面分析法确定利用双酶提取林蛙皮中透明质酸最佳工艺条件获得的得率27.68 mg/g较高,且条件准确可行。2.透明质酸精品纯度达到92.0%,葡萄糖醛酸占42.2%。凝胶色谱法测得HA的相对分子质量为8.5×105、9.2×105,分子量的数值在40～100×104的范围内;细菌总数检测符合相关规定标准。3.小鼠皮肤和口服的急性毒性试验表明透明质酸对小鼠是无毒的,经过小鼠皮肤试验(重量法)表明从蛙皮中提取的透明质酸具有保湿作用。4.自制透明质酸化妆水配方为透明质酸粉末0.5-1,A 0.1,PEG-150二硬脂酸酯0.1,水98.8-99.3。经小鼠的皮肤涂抹试验表明透明质酸化妆水具有明显的保湿作用。