研究背景在所有类型的人类肿瘤中,胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）的治疗属于最具挑战之一。作为成人中最常见和最致命的原发脑恶性肿瘤,其生长方式的特点为膨胀性与浸润性,即使应用手术（最大保护脑功能前提下最大范围切除肿瘤）、术后同步放化疗及后续辅助化疗的标准治疗方案,GBM患者的中位生存期仅为12-15个月,5年生存期低于10%。随着对GBM分子病理和基因组学等认识不断加深,发现了参与维持肿瘤恶性生物行为的多条核心信号通路异常调节,如PI3K/AKT、RB、p53等,而临床试验结果提示,目前针对这些关键信号通路的分子靶向治疗效果有限,具有明显的局限性,应证了 GBM具有高度的异质性,其发生发展不是单一信号通路或分子所调节的。因此发现GBM相关的异常信号转导途径及关键调控分子将有助于了解肿瘤发生发展机制,探索新的靶向治疗策略,从而走出目前临床胶质瘤精准治疗的困境。核因子活化 B 细胞 κ 轻链增强子（Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activatedBcells,NF-κB）是一种可以控制DNA转录、细胞因子产生的同源或异源二聚体DNA 结合复合体,由 p50（NF-κB1,p105）,p52（NF-κB2,p100）,p65（RelA）,RelB 和 c-Rel五个结构相关的亚基组成,通常存在于胞质中,与抑制蛋白Iκ(B（Inhibitor of NF-κB）结合形成三聚体而失活。当上游信号因子刺激相应受体并传递至IKK（IκB kinase）激酶复合物后,使IκB蛋白磷酸化及降解,而NF-κB从三聚体中解离出且暴露出核定位基序（Nuclear localization motif,NLM）,进入细胞核内促进下游基因转录。近年来研究发现,NF-κB异常活化除与炎症和免疫系统疾病有关,还可能在包含GBM在内的多种人类肿瘤中起到促癌作用,巩固了肿瘤细胞的快速增殖、血管新生、治疗抵抗等恶性表型。尽管NF-κB信号通路对于GBM恶性表型如快速生长和治疗抵抗等至关重要,但目前针对该通路的药物开发仍处于非特异性或特异性靶向IKK激酶但副作用过大的瓶颈,在多项临床试验中相较于标准疗法,GBM患者预后并未取得较大改善。因此,深入研究GBM中NF-κB异常活化机制,剖析该通路的基因调控网络,将有助于采取不同以往的研究策略,研发小分子抑制剂,解决GBM临床治疗的窘境。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）,是一类长度大于200个核苷酸（Nucleotide,nt）、生物学功能丰富的非编码RNA。随着二代测序技术的迅速发展,数量巨大的lncRNA被发现。由于其数量远超编码蛋白的基因,有望为寻找肿瘤诊断及预后生物标志物、治疗靶点提供广阔的研究空间。LncRNAs参与了多层面调控基因表达的过程,例如染色体失活、基因组印记、染色质修饰、转录激活或干扰等,可能通过与蛋白质、RNA、DNA等相互作用发挥生物学功能。近年来研究发现表达失调的lncRNAs,能通过上述的调控方式,介导肿瘤相关的核心信号通路,影响包括GBM在内的多种肿瘤细胞的血管新生、侵袭迁移、恶性增殖、治疗抵抗等多种生物学行为。越来越多研究证实,除了一系列的蛋白和miRNAs,lncRNAs也与NF-κB信号通路密切相关。例如,NKILA（NF-κB interacting lncRNA）在乳腺癌细胞中表达可受到NF-κB转录水平调控,同时还能通过抑制IκBα磷酸化和NF-κB信号通路活性起到负向反馈调控的作用;MALAT1（Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1）则可以与 p65-p50 蛋白复合物相互作用,减弱其DNA结合能力,从而起到抑制NF-κB转录活性的功能。LncRNA-NF-κB的交联及潜在机制的探索已成为当下研究的热点之一。长链非编码RNA（Second chromosome locus associated with prostate-1;LINC00913）,作为lncRNA的一员,文献报道其在前列腺癌、膀胱癌等多种常见肿瘤中发挥癌基因作用,介导了肿瘤细胞的恶性增殖、转移等表型,其高表达量提示患者预后不佳。本课题组前期使用qRT-PCR初步检测了SChLAP1在正常脑和WHO Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤组织中的表达水平,发现其倾向高表达于胶质瘤组织,并且呈现显著的级别相关性,提示SChLAP1可能与胶质瘤恶性演变有关,但其与胶质瘤一些主要分子标志物如IDH突变、ATRX突变等的相关性未见报道,仍有待阐明。此外SChLAP1在GBM的作用和调控机制尚不清楚,仍有待深入研究。泛素化修饰是翻译后修饰（Post-translational modification,PTM）的一种常见形式,其具有直接调控蛋白质功能和去向的作用,广泛参与到各种细胞活动中。其中泛素的Lys-48（K-48）和Lys-63（K-63）是最常见的多聚泛素链连接位点:K-48泛素链是底物被招募至26S蛋白酶体降解的标示;K-63泛素链则起着酶活性改变、信号转导和细胞内吞的作用。已有文献报道,K-48和K-63连接型多聚泛素化修饰方式可通过影响经典和非经典NF-κB信号通路各重要组件的表达和功能,介导信号转导的活性。泛素化反应往往需要多种泛素化相关酶,如泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素-蛋白连接酶E3的协同合作才能完成,其中任何一步发生异常都有可能导致信号通路异常,乃至于疾病如肿瘤的发生。相比于E1和E2,由于E3庞大的数量,与底物间的特异性识别等特点,吸引了研究者格外的关注。TRIM（Tripartite motif）蛋白家族,由于具有3个高度保守的结构域得名,其结构特征是从N端RING结构域开始,随后一个或两个B box域,然后是卷曲螺旋域的域簇,已被报道在多种正常细胞中通过E3泛素连接酶活性参与调控NF-κB转录活性。然而,具体哪些TRIM基因能在GBM细胞中调控NF-κB转录活性以及潜在调控机制尚不清楚,值得进一步探究。本论文利用多种技术手段,分两部分深入研究了 lncRNA SChLAP1和E3连接酶TRIM22促进GBM恶性生物学行为的作用及调控NF-κB转录活性的具体分子机制,为GBM治疗的靶点选择以及未来靶向药物研发提供新的思路。第一部分:LncRNA 与HNRNPL蛋白形成复合物促进胶质母细胞瘤恶性增殖目的揭示lncRNASChLAP1在正常脑组织和不同级别胶质瘤组织中的表达水平和GBM细胞系中的表达分布,分析其与胶质瘤临床分子病理学特征的相关性,探究SChLAP1对GBM体外细胞增殖和体内成瘤生长的影响,筛选并鉴定特异互作的蛋白,明确两者间相互作用的生物学功能及对下游信号通路的影响。方法1.利用RNA原位杂交（RNA in situ hybridization,RNA-ISH）检测正常脑组织和不同级别胶质瘤组织中SChLAP1的表达;RNA荧光原位杂交（RNA fluorescence in situ hybridization,RNA-FISH）、核质分离后qRT-PCR检测SChLAP1在人源正常星形胶质细胞（Normal Human Astrocytes,NHAs）及 GBM 细胞系 LN229,U118MG,GBM#P3 和 BG7中的表达分布。2.利用qRT-PCR验证敲减或外源性过表达SChLAP1慢病毒的效率;细胞直接计数和平板克隆形成实验检测上述操作对胶质瘤细胞体外恶性增殖能力的影响;构建裸鼠原位移植瘤模型,利用小动物活体成像系统定时观察上述操作对胶质瘤细胞体内生长的影响;Kaplan-Meier生存曲线分析荷瘤小鼠生存期的变化。3.利用RNA pull-down结合LC-MS/MS法筛选SChLAP1在胶质瘤细胞系中的候选相互作用蛋白;RNA免疫沉淀实验（RNA immunoprecipitation,RIP）验证SChLAP1与HNRNPL间的相互作用;RNA pull-down探究两者作用的具体结构域。4.利用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）结合LC-MS/MS法筛选并鉴定ACTN4为SChLAP1-HNRNPL复合物下游的候选癌蛋白;免疫组化检测ACTN4蛋白在正常脑组织和不同WHO级别的胶质瘤组织中的表达;基于Rembrandt和CGGA数据库,绘制ACTN4表达量相关的生存曲线图;Co-IP研究ACTN4-HNRNPL作用的具体结构域。5.使用蛋白酶体抑制剂MG132（20μM）和蛋白合成抑制剂放线菌酮（Cycloheximide,CHX;25μg/mL）预处理相应胶质瘤细胞,Western blot检测敲减或外源过表达SChLAP1对ACTN4蛋白表达水平和半衰期的影响;体内泛素化实验检测上述操作对ACTN4蛋白的总泛素化修饰水平的影响;MG132预处理8h后,使用Co-IP研究SChLAP1对ACTN4-HNRNPL间相互作用的影响。6.基于CGGA数据库,对ACTN4相关的基因同时结合临床病理特征进行聚类热图分析;利用Venn图分析比对ACTN4相关的基因和NF-κB通路下游靶基因;荧光素酶报告基因系统检测敲减或过表达SChLAP1对NF-κB转录活性的影响;核质蛋白分离及免疫荧光检测分析上述操作对P65蛋白亚细胞定位的影响。结果1.LncRNA SChLAP1在胶质瘤中的表达及亚细胞定位RNA-ISH结果显示,SChLAP1在正常脑组织中几乎不表达。相比于低级别胶质瘤（LGG,WHO Ⅱ）,SChLAP1更倾向高表达于高级别胶质瘤（HGG,WHO Ⅲ-Ⅳ）,在GBM内表达最充足。其表达量与胶质瘤WHO分级,野生型IDH1显著正向相关。RNA-FISH 结果显示,在 GBM 细胞系 LN229,U118MG,GBM#P3 和 BG7 中,Cy3-SChLAP1荧光信号较NHA中更强。核质分离后的qRT-PCR检测分析提示,SChLAP1主要表达于细胞核内,少量分布于胞浆中。2.敲减SChLAP1对胶质母细胞瘤恶性进展的影响qRT-PCR检测结果显示,两条靶向SChLAP1的短发夹RNAs（Short hairpin RNAs,shRNAs）慢病毒能在LN229和GBM#P3中有效下调SChLAP1。细胞直接计数和平板克隆形成实验显示,敲减SChLAP1能显著抑制GBM细胞的体外增殖能力。通过建立原位移植瘤模型及小动物活体成像系统定时观察发现,敲减SChLAP1能明显延缓GBM细胞在体内的生长,并且相较于对照组,明显延长小鼠的中位生存期。3.筛选并鉴定RNA结合蛋白HNRNPL与SChLAP1在胶质瘤细胞中存在相互作用RNA pull-down结合LC-MS/MS法筛选鉴定HNRNPL蛋白是SChLAP1的候选互作蛋白之一,其主要的结合区域为HNRNPL的RRM2与SChLAP1的exon2（338-433 bp）。RIP实验结果进一步确认了两者的结合。此外,外源性调控SChLAP1表达不影响HNRNPL蛋白水平,但敲低HNRNPL会导致SChLAP1降解速率加快,提示SChLAP1-HNRNPL存在紧密的相互作用,可能形成复合物来发挥作用。4.筛选并鉴定ACTN4为SChLAP1-HNRNPL复合物下游的候选癌基因Co-IP结合LC-MS/MS法筛选鉴定ACTN4为SChLAP1-HNRNPL复合物下游的候选癌蛋白之一,负责结合的区域是ACTN4的Rod和CaM-like结构域及HNRNPL的RRM3结构域。免疫组化结果提示,ACTN4蛋白表达量与患者年龄,野生型IDH1,野生型ATRX及胶质瘤WHO分级呈显著正相关。Rembrandt和CGGA数据库的生存曲线与Log-rank检验提示,ACTN4高表达与患者预后不佳显著相关。5.SChLAP1-HNRNPL复合物对ACTN4蛋白稳定性的影响和调控机制Western blot结果显示,外源性调控SChLAP1表达与ACTN4蛋白表达变化趋势一致,并且胶质瘤细胞系及患者样本中SChLAP1与ACTN4蛋白水平呈正相关关系。进一步研究发现,敲减SChLAP1能在不影响ACTN4 mRNA表达情况下,降低ACTN4蛋白水平,使用MG132处理却能恢复到正常,提示SChLAP1可能参与抑制了 ACTN4蛋白的蛋白酶体-泛素化降解,Cycloheximide chase assay 与 in vivo ubiquitination assay 也证实了这一点。Co-IP结果显示,过表达 SChLAP1会增加HNRNPL与ACTN4的相互作用,敲减SChLAP1则反之。6.SChLAP1对ACTN4下游NF-κB信号通路活性的影响基于CGGA数据库,聚类热图分析得出ACTN4的1046个正向与668个负向相关基因,而且ACTN4的表达升高与胶质瘤WHO分级、Classical亚型、患者年龄及野生型IDH1正相关。此外通过比对NF-κB靶基因公共数据库（http://bioinfo.lifl.fr/NF-KB/）与ACTN4相关基因,显示存在19个基因的重合;荧光素酶报告基因系统检测结果显示,敲减SChLAP1能减弱胶质瘤细胞内NF-κB转录活性,而过表达SChLAP1的效果相反;核质蛋白分离及免疫荧光检测分析显示,敲减SChLAP1能减少P65蛋白在细胞核内定位,而过表达SChLAP1能促进P65蛋白核内表达。7.SChLAP1与HNRNPL蛋白相互作用对胶质母细胞瘤恶性进展的影响细胞直接计数实验显示,过表达SChLAP1所导致的GBM细胞体外增殖能力增强,能被SChLAP1-exon2缺失或敲减HNRNPL抑制。通过建立原位移植瘤模型及小动物活体成像系统定时观察发现,过表达SChLAP1所导致的GBM细胞在体内生长加剧,及明显缩短小鼠中位生存期,同样可以被exon2缺失或敲减HNRNPL抑制。结论1.SChLAP1高表达于高级别胶质瘤,与多个临床病理指标正相关;2.SChLAP1与HNRNPL形成复合物发挥促癌作用,HNRNPL是其下游的关键效应分子;3.SChLAP1能加强HNRNPL与ACTN4结合,减少ACTN4蛋白的蛋白酶体-泛素化途径降解,从而增强其蛋白稳定性;4.SChLAP1能通过调控ACTN4蛋白表达驱动P65蛋白核转位以激活NF-κB转录,从而促进GBM细胞恶性增殖。第二部分:TRIM22通过其E3泛素连接酶活性激活NF-κB信号通路促进胶质母细胞瘤恶性增殖目的筛选鉴定出在GBM细胞内最可能参与激活NF-κB信号通路的TRIM基因,揭示其在正常脑组织和不同级别胶质瘤组织中的蛋白表达水平,分析其与胶质瘤临床分子病理学特征的相关性,探究其对GBM体外细胞增殖和体内成瘤生长的影响及激活NF-κB信号通路的分子机制。方法1.利用NF-κB荧光素酶报告基因系统筛选在GBM细胞系U87MG和LN229内可能参与激活NF-κB信号通路的TRIM基因。2.免疫组化检测TRIM22蛋白在正常脑组织和不同WHO级别胶质瘤组织中的表达水平。3.利用Co-IP探究TRIM22-IκBα和TRIM22-IKKγ蛋白间相互作用。4.利用Western blot验证Cas9-sgRNA敲除或外源性过表达慢病毒的效率;细胞直接计数和Ki-67免疫荧光染色实验检测上述操作对胶质瘤细胞体外恶性增殖能力的影响;荧光素酶报告基因系统检测上述操作对NF-κB转录活性的影响;核质蛋白分离及免疫荧光检测分析上述操作对P65蛋白亚细胞定位的影响;构建裸鼠原位移植瘤模型,利用小动物活体成像系统定时观察上述操作对胶质瘤细胞体内生长的影响;Kaplan-Meier生存曲线分析荷瘤小鼠生存期的变化。5.使用蛋白酶体抑制剂MG132和蛋白合成抑制剂CHX预处理相应胶质瘤细胞,Western blot检测敲除或外源过表达TRIM22或TRIM22酶失活突变体对IκBα蛋白表达水平和半衰期的影响;体内/外泛素化实验检测上述操作对IκBα蛋白K-48连接型泛素化和IKKγ蛋白K-63连接型泛素化修饰水平的影响。结果1.筛选鉴定在胶质瘤细胞中参与正向调控NF-κB信号通路的TRIM基因及表达情况NF-κB荧光素酶报告基因系统检测结果显示,经过初步筛选后的5个TRIM基因中（TRIM5,TRIM21,TRIM22,TRIM38,TRIM56）,只有敲减TRIM22 后,能在 U87MG和LN229两个GBM细胞系内均明显下调NF-κB转录活性;免疫组化结果提示,TRIM22蛋白表达量与野生型IDH1,野生型ATRX及胶质瘤WHO分级呈显著正相关,正常脑组织中几乎不表达。2.敲除TRIM22对胶质母细胞瘤恶性进展的影响Western blot 结果显示,两条靶向TRIM22 的不同序列 sgRNAs（Small guide RNAs,sgRNAs）慢病毒能在稳定表达Cas9的U87MG和LN229中有效敲除TRIM22;在不影响总蛋白表达的情况下,统一下调NF-κB信号通路内关键元件IKKα/β（Ser176/180）,IκBα（Ser32/36）,P65（Ser536）的磷酸化水平,同时上调IκBα总蛋白水平。细胞直接计数和Ki-67免疫荧光染色实验显示,敲除TRIM22能显著抑制GBM细胞的体外增殖能力。通过建立原位移植瘤模型及小动物活体成像系统定时观察发现,敲除TRIM22能明显抑制GBM细胞在体内的生长速度,而且与对照组相比,显著延长小鼠的中位生存期。3.TRIM22依赖其E3连接酶活性发挥促进胶质母细胞瘤恶性进展的作用Western blot结果显示,相比于对照组（Flag-EV）,在LN229和U118MG细胞中过表达TRIM22全长蛋白（Flag-TRIM22-FL）,NF-κB信号通路内关键元件IKKα/β（Ser176/180）,IκBα（Ser32/36）,P65（Ser536）的磷酸化水平统一地上调,同时 IκBα总蛋白水平下降,而过表达TRIM22的2个E3酶失活体（Flag-TRIM22-ARING/-TRIM22-C15/18A）均无法调控上述蛋白水平变化。细胞直接计数和Ki-67免疫荧光染色实验显示,过表达TRIM22（Flag-TRIM22-FL）能显著加强GBM细胞的体外增殖能力。通过建立原位种瘤模型及小动物活体成像系统定时观察发现,过表达TRIM22（Flag-TRIM22-FL）能明显加快GBM细胞在体内的生长速率,相比于对照组,显著延长荷瘤小鼠的中位生存时间。但过表达 TRIM22 的 E3 酶失活体（Flag-TRIM22-ΔRING/-TRIM22-C1 5/18A）对GBM细胞在体内外的增殖能力无显著影响,与对照组对比无差异,小鼠生存期同样未见显著变化。此外,荧光素酶报告基因系统检测结果显示,过表达TRIM22（Flag-TRIM22-FL）能显著增强胶质瘤细胞内NF-κB转录活性;核质蛋白分离及免疫荧光检测分析显示,过表达TRIM22（Flag-TRIM22-FL）能促进P65蛋白在细胞核内定位。但相较于对照组,过表达 TRIM22 的 E3 酶失活体（Flag-TRIM22-ΔRING/-TRIM22-C1 5/18A）后 GBM 细胞的NF-κB转录活性和P65核定位均无显著变化。4.TRIM22对IκBα蛋白稳定性的影响和调控机制进一步实验分析表明,敲除TRIM22能在不影响IκBα mRNA表达情况下,升高IκBα蛋白水平,而过表达TRIM22能使IκBα蛋白水平下降,但E3酶失活体却失去了调控作用,提示TRIM22调控IκBα蛋白水平可能是通过蛋白酶体-泛素化降解的方式。Cycloheximide chase assay结果提示,相比于对照组,敲除TRIM22能显著延长IκBα蛋白降解半衰期,过表达TRIM22则反之,而TRIM22的E3酶失活体没有任何影响。In vitro/vivoubiquitinationassay 结果也佐证了这一点。Co-IP 结果显示,TRIM22 与 IKBα蛋白间存在相互作用,主要结合区域是TRIM22蛋白的89-131aa（B-Boxdomain）/133-223aa（Coiled-coil domain）/352-498aa（SPRY domain）和 IKBα 蛋白的 182-317aa（AR4/AR5）。5.TRIM22对NF-κB通路内IKK复合物的调节亚基IKKγ的影响和调控机制Co-IP 结果显示,在 GBM 细胞系 U87MG,LN229,U118MG,TRIM22 与IKKγ蛋白存在内源性相互作用;In vivo ubiquitination assay 结果显示,敲除TRIM22能明显下调IKKγ蛋白的K-63型多聚泛素化修饰水平,过表达TRIM22则反之,而TRIM22的E3酶失活体没有任何影响。6.IκBα是TRIM22发挥促胶质母细胞瘤进展作用的关键下游蛋白荧光素酶报告基因系统检测结果显示,过表达TRIM22所导致的GBM细胞NF-κB转录活性增强,能被srIκBα过表达所抵消。细胞直接计数实验显示,过表达TRIM22所导致的GBM细胞体外增殖能力增强,能被srIκBα过表达所抑制。通过建立原位种瘤模型及小动物活体成像系统定时观察发现,过表达TRIM22所导致的GBM细胞在体内生长加剧,及明显缩短的小鼠中位生存时间,而上述增强效果可由过表达srIκBα显著抑制。结论1.TRIM22是维持GBM细胞内NF-κB高转录活性的重要癌基因;2.TRIM22蛋白常高表达于高级别胶质瘤,与多个临床病理指标正相关;3.TRIM22依赖E3泛素连接酶功能,通过蛋白间相互作用的方式分别促进IKKγ的K-63型多聚泛素化和IκBα的K-48型多聚泛素化,以此激活NF-κB信号通路进而促进GBM进展。