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当前肿瘤免疫治疗取得显著进展的同时仍面临诸多挑战。嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor-T,CAR-T)疗法及免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade,ICB)治疗对于实体肿瘤内部的深入递送效率问题是其临床应用的主要局限之一。巨噬细胞作为先天免疫细胞,具有肿瘤募集特性并可深入浸润至实体肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME),这使巨噬细胞可能通过基因工程功能化改造成为良好的细胞治疗工具。为此以Affibody为模式分子建立功能化效应蛋白的跨膜表达平台,通过基因工程技术在巨噬细胞胞外表达人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的配体Affibody结构域,构建功能化巨噬细胞,使其不仅能够直接靶向HER2阳性乳腺癌细胞的HER2-EGF信号通路抑制肿瘤生长,还能够作为载药活细胞靶向递送抗肿瘤药物协同抗肿瘤。本论文具体研究内容及结果如下:(1)借助CAR-T的体胞外结合理念,受益于包膜病毒的侵染出芽表达机制,采用慢病毒载体构建信号肽引导的功能蛋白跨膜展示技术,以Affibody为模式分子成功建立蛋白跨膜表达平台,于细胞膜表面表达跨膜Affibody配体,筛选获得具有高亲和HER2结合活性的Affibody-RAW264.7稳准细胞系。实时荧光定量PCR反应(quantitative real-time PCR,RT-q PCR)、蛋白质免疫印迹分析(western blot,WB)及共聚焦结果显示了Affibody-GFP融合蛋白的成功表达,流式细胞术、荧光显微镜技术及免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,CO-IP)结果成功验证了Affibody的HER2结合活性;(2)利用transwell技术对跨膜表达功能化巨噬细胞Affibody-RAW264.7的HER2阳性肿瘤细胞趋向性进行验证。结果显示与未修饰的巨噬细胞RAW264.7相比,经过基因工程修饰的功能化巨噬细胞Affibody-RAW264.7展现了更强的体外HER2阳性肿瘤靶向能力。同时利用活细胞监测及乳酸脱氢酶技术在细胞水平对Affibody-264.7的体外杀伤能力进行检测,结果表明跨膜表达Affibody的功能化巨噬细胞具有显著的HER2阳性乳腺癌杀伤效应,且这种特性随着效靶比的增强而增强;(3)以构建的功能化巨噬细胞为载药系统,以包载DOX的PLGA胶束为模型分子开发新功能载药平台,荧光显微镜观察实现了药物的活细胞搭载。同样,使用活细胞监测及CCK8技术对普通巨噬细胞RAW264.7、功能化巨噬细胞Affibody-RAW264.7、载药功能化巨噬细胞Affibody-RAW264.7/PLGA-DOX的体外肿瘤杀伤能力进行的监测与比较,PBS作为无治疗对照组。结果显示Affibody-RAW264.7/PLGA-DOX具有最显著的体外肿瘤杀伤作用,Affibody-RAW264.7次之,RAW264.7最差,且三者的杀伤效应同样与其效靶比成正比;(4)构建立HER2阳性乳腺癌模型,利用组织切片技术于小鼠层面确定了功能化巨噬细胞Affibody-RAW264.7的体内肿瘤深入递送能力,利用活体小鼠测量技术检测了RAW264.7、Affibody-RAW264.7、Affibody-RAW264.7/PLGA-DOX体内肿瘤杀伤作用,PBS同样作为无治疗对照。小鼠肿瘤实验数据显示出了与体外肿瘤杀伤监测实验相同的结论,进一步确保了跨膜表达Affibody分子的功能化巨噬细胞作为新一代癌症治疗平台的可能性。